硇洲马尾藻(S.naozhouense)褐藻多酚的抗凝血活性研究

卢虹玉，陈晓敏，欧小蕾，毛俊杰，吉宏武

广东海洋大学水产品深加工广东普通高校重点实验室，湛江 524088

硇洲马尾藻(S.naozhouense)属褐藻门、马尾藻科、马尾藻属(Sargassum)海洋大型藻类［1］，俗称黑菜，广泛分布于湛江硇洲岛海域且已经开始人工养殖［2］。因其具有清火、解喉毒和利尿等功效，当地渔民每年都大量采集食用，有很高的食用和药用价值。但目前关于硇洲马尾藻的研究与开发利用报道较少见，仅有少量报道对其基本营养成分和多糖进行了研究［3，4］，对其他生物活性成分研究未见报道。

海藻多酚是海藻中多酚类化合物的总称，因具有独特的生理活性，近年来成为研究热点。其中褐藻中存在一类间苯三酚类单宁物质，被称为褐藻多酚(Phlorotannins，PTs)，为间苯三酚衍生物，结构复杂多样。大量研究表明，PTs具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抗菌、抗凝血等等多种生物活性［5］。本研究拟从硇洲马尾藻中提取PTs，进行体内和体外的抗凝血活性研究，为开发新型抗凝血或抗血栓药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料试剂

真空冷冻干燥机(东京理化)，旋转蒸发仪(东京理化)，高速冷冻离心机(日本日立)，UV-2550紫外分光光度计(日本岛津)，数显恒温水浴锅(东京理化)，回旋流/切向流超滤器(德国赛多利斯)，蠕动泵(美国BARNANT)，微量移液器(美国吉尔森)。

硇洲马尾藻全藻体由广东海洋大学水产学院谢恩义教授鉴定和提供，采集于湛江徐闻。清水洗去表面泥沙及附生物，风干后粉碎待用。

昆明小鼠，6～8周龄，雄性;成年新西兰兔。均由广东医学院SPF级动物中心提供。

Folin-酚试剂(北京鼎国生物技术有限公司);没食子酸(Gallic acid，GA)(中国药品生物制品检定所);阿司匹林(拜耳医药保健有限公司);凝血酶原时间试剂盒;凝血酶时间试剂盒(南京建成生物工程研究所);其它试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 褐藻多酚提取

海藻干粉按1∶10(质量体积比)加入80%甲醇水溶液，室温下避光振荡16 h，过滤后残渣重复浸提2次，合并上清夜，35℃避光真空旋转蒸发浓缩去甲醇，水溶液以等倍体积乙醚和氯仿分别萃取2次，取水相，超滤(截留分子10K)，得水层内液NW1(＞10K高分子量)和水层外液NW2(＜10K低分子量)，真空冷冻干燥至粉末，-20℃保存。

1.2.2 总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法［6］测定多酚含量。上述提取物分别配制成一定浓度。在10 mL容量瓶中加入1 mL待测液、2 mL 1 mol/L的福林酚试剂乙，摇匀后静置2 min，缓慢加入6 mL 12%Na2CO3，定容至10 mL，迅速摇匀，室温放置1 h，765 nm处测定吸光度。以GA为标准品，制作标准曲线，得回归方程:Y=0.1467X+0.0048，R2=0.9995，根据标准曲线计算总酚含量。

1.2.3 体内抗凝血活性

1.2.3.1 凝血时间(coagulation time，CT)测定(毛细管法)［7］

健康雄性昆明小鼠80只，随机分成8组，每组10只小鼠，分别为:NW1中、高、低浓度各1组，NW2中、高、低浓度各1组，生理盐水组和阿司匹林对照组。每天固定时间给药，NW1和NW2中高低给药剂量分别为 10、20、40 mg/kg.d，阿司匹林 20 mg/kg.d。连续灌胃给药7 d后，于末次灌胃给药1 h后将毛细管(内径1.0 mm，长120 mm)插入小鼠眼内眦眼球后静脉丛，自血液流入开始计时，注满后取出平放于桌面，每隔5 s折断毛细管两端约0.5 cm，并缓慢向左右拉开，直至凝血丝出现为止，所经历的时间即为凝血时间CT。

1.2.3.2 出血时间(bleeding tim，BT)测定(剪尾法)［7］

动物实验分组及给药同上2.3.1，于末次灌胃给药30 min后，以酒精摩擦小鼠尾部至血管扩张，以剪刀在距离小鼠尾尖0.3 cm处剪断，立即计时，每隔20 s用滤纸吸取血滴1次，直至血流停止(以滤纸吸至无血迹时为准)，记录出血时间BT。

1.2.4 体外抗凝血活性

1.2.4.1 血浆凝血酶原时间(prothrombin time，PT)测定［8］

新西兰兔正常喂养。实验前按新鲜静脉血与0.109 M 柠檬酸钠体积比为9∶1，预先加入0.109 M柠檬酸钠溶液。选取兔子静脉较粗较清晰的耳朵，修剪采血部位的毛，用酒精多次擦洗，消毒，并使血管扩张充血。用刀片在血管上切一小口，让血液自然流至预先装有柠檬酸钠管中，轻缓混匀，3000 rpm低温离心15 min，收集上层液体，即为待测血浆，2 h内进行实验。取待测血浆0.1 mL，分别加入0.05 mL 浓度为 1.0、5.0、10.0、15.0 mg/mL 的 NW1 和NW2，空白对照组加0.05 mL蒸馏水，阳性对照组加0.05 mL 1.0 mg/mL的阿司匹林，然后根据试剂盒说明进行操作，记录凝固时间，即为PT值。每组平行测定10次。

1.2.4.2 血浆凝血酶时间(thrombin time，TT)测定［8］

血浆制备方法和实验组组别设置及浓度设置同2.4.1，然后根据试剂盒说明进行操作，记录凝固时间，即为TT值。每组平行测定10次。

1.2.5 数据统计与分析

应用SPSS、EXECL进行统计学处理，数据均以“平均值±标准偏差”表示，组间用t检验与LSD检验。

2 结果与分析

2.1 总酚含量测定结果

测定结果表明(表1)，NW1和NW2的总酚含量相近，以提取物干粉计分别为2.4和2.2 mg GA/g，以海藻干基计分别为0.324 mg GA/g，以干粉质量计提取率分别为13.51%和14.06%。

表1 总酚含量测定结果Table 1 Total phenolic content of extractive from S.naozhouense

2.2 体内抗凝血活性

2.2.1 硇洲马尾藻褐藻多酚对CT的影响

表2数据显示，与生理盐水组相比，不同剂量NW1和NW2组的CT均有不同程度的延长，且差异性显著。其中 NW1中剂量(20.0 mg/kg.d)对 CT的作用最显著，为133.47 s，比生理盐水组延长了84.78%，随着剂量的增加，CT有所下降，说明NW1对CT的作用存在一个最佳剂量，浓度太高反而效果降低，这与魏玉西等［9］报道的鼠尾藻多酚的抗凝血作用相似。NW2高剂量组的CT相对较长。总的来说，低中高剂量的NW2对CT的作用没有呈现出剂量与效果的明显规律。

2.2.2 硇洲马尾藻褐藻多酚对BT的影响

BT测定结果表明(表2)，与生理盐水组对比，NW1组中高低剂量均能显著延长BT，其中低剂量和高剂量的延长效果优于中剂量，最多延长了82.96%;NW2组不同剂量对BT的延长作用极为显著，均延长了一倍以上，高剂量比生理盐水组延长近1.6倍，比阿司匹林组延长了1.1倍。总体来说，NW2对BT的作用强于NW1。

表2 硇洲马尾藻多酚对CT和BT的影响(n=10)Table 2 Effects of phlorotannins from S.naozhouense on CT and BT(n=10)

2.3 体外抗凝血活性

2.3.1 硇洲马尾藻褐藻多酚对PT的影响

表中数据显示(表3)，NW1能显著延长PT，并表现出剂量时间依赖关系，当浓度为15 mg/mL时，PT为21.24 s，比对照延长了63.38%，显著高于阿司匹林组;NW2在低浓度时表现出较低的PT延长活性，和生理盐水组相比，没有显著性差异，随着浓度的增加，NW2反而表现出显著的缩短PT作用。

表3 硇洲马尾藻多酚对PT和TT的影响(n=10)Table 3 Effects of phlorotannins from S.naozhouense on PT and TT(n=10)

2.3.2 硇洲马尾藻褐藻多酚对TT的影响

从表3可看出，NW1对TT的延长作用极为显著，并呈现剂量依赖关系，随着浓度的增加，15 mg/mL的浓度组比生理盐水组延长了近4倍(生理盐水组的TT值在正常参考值范围内)，远高于阿司匹林组。NW2在低浓度时，有一定的剂量依赖关系，随着浓度的增加，TT不再增加，5.0～15 mg/mL范围内NW2对TT的作用没有显著差异性。对比NW1和NW2对TT的效果可以看出，NW1的作用更加显著，这一点与两者对PT的作用相似。表中数据还说明，阴性对照组的 PT(13.00±1.26s)和TT(14.00±0.85 s)测定结果分别在正常参考值10.7-14.3s和10.0 ～18.0 s范围内，说明新鲜血浆的制备符合试剂盒的测定要求。

3 讨论

褐藻多酚是海藻中一类重要的次生代谢产物，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、降血脂等多种活性。本研究通过体内和体外实验对硇洲马尾藻褐藻多酚的抗凝血作用进行了初步探讨。

凝血过程是一种复杂的模式，包括内源性凝血途径和外源性凝血途径，两者之间可以相互活化，并最终汇总于凝血酶形成和纤维蛋白形成的共同途径。不同的抗凝血药物作用的途径不同，表现出的相应机制也不同。体内实验结果表明，硇洲马尾藻褐藻多酚NW1和NW2对CT和BT均有显著延长作用，但两者的作用不同，分子量相对大的NW1对CT的效果优于分子量相对小的NW2，魏玉西等［9］报道的结果与此类似。NW2对BT的延长效果显著高于NW1。由于CT是内源性凝血途径因子，而BT更多受血小板和毛细血管的影响，受凝血因子的影响相对较少，NW2主要为小分子量提取物，其中所含的成分相对更为复杂。因此，NW1和NW2产生的作用效果不同是正常现象。本实验中采用的阿司匹林剂量与魏玉西等和丁丽等的研究一致［9，10］，但对CT的延长效果不显著，他们的研究结果表明20 mg/kg.d的阿司匹林给药剂量对小鼠具有显著延长CT作用，可能与所使用的阿司匹林生产厂家不同有关，也有相关报道采用100 mg/kg.d高剂量的阿司匹林作为阳性对照。体外实验检测了硇洲马尾藻褐藻多酚对PT和TT的作用，其中PT反映的是外源性凝血途径，TT反映的是共同凝血途径。

从以上结果可以看出，NW1对分别代表内源和外源的CT和PT均有显著延长作用，对BT和代表共同途径的TT也有显著延长作用，是比较全面的抗凝血物质，而NW2对外源凝血途径(PT)不起作用甚至起相反作用，对内源性凝血途径(CT)和共同途径(TT)有一定作用，对BT作用显著。推测相对分子量较大的NW1的抗凝血作用可能更多的与凝血途径因子相关。如抗凝血药物肝素也有类似的现象，肝素的抗凝血因子IIa活性与其分子量有关，分子量在5400D以上才具有抗IIa活性［11］，并随分子量增加活性升高;NW2可能更多的作用于其他方面。两者的具体作用机制有待进一步研究。

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