马尾松花粉醇提物降脂作用与预防肥胖的实验研究

宋 航，张 含，刘 铭，许继敏，耿 越

山东省动物抗性生物学重点实验室生命科学学院山东师范大学，济南 250014

肥胖是由于食物摄入过多或机体代谢改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重的过度增长，并引发机体生理病理性改变。现代人常见的饮食无序、长久静坐、缺乏运动等生活方式会导致体内脂肪代谢率下降，积累过多会形成肥胖，进而容易可引发心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪肝等多种疾病。所以寻找合适的方法促进体内脂质代谢对于预防肥胖相关疾病的发生具有重要意义。

松花粉入药为松黄，在我国多部医书中曾有“久服轻身益气力”、“久服令轻身”等记载，药用和食用历史悠久。近年来，国内外对松花粉有益成分、药理作用和生理功能进行了大量的相关研究。据相关实验分析，马尾松花粉含有18种人体必需的氨基酸和10多种维生素以及核酸、酶类、黄酮类、矿物质、不饱和脂肪酸、膳食纤维等有益降血脂的物质。有研究发现破壁松花粉在降低体脂质水平和增加脂质排泄方面具有良好的效果。

本实验以破壁马尾松花粉为原料，进一步探讨松花粉中醇提物组分对机体脂质代谢的调控及预防肥胖的初步机制。

1 材料与方法

1.1 破壁马尾松花粉

破壁马尾松(Pinus massoniana)花粉由烟台新时代健康产业集团提供，破壁率大于95%。破壁方法采用低温气流粉碎法［1］。

1.2 动物分组及饲养方法

选取100只4周龄昆明白雄性小鼠，实验开始前适应性喂养一周，筛选出初体重为(19±1)g的小鼠60只，随机分为6组:松花粉醇提物低剂量(EEL，0.0625 g/kg bw·d)、中剂量(EEM，0.125 g/kg bw·d)和高剂量(EEH，0.25g/kg bw·d)三个组;奥利司他阳性对照组(PC，0.05g/kg bw·d);空白对照组(NC)和高脂饲粮组(FC)。

小鼠饲养环境及操作:每笼5只;环境温度(22±2)℃，湿度30% ～70%;日光灯照明12 h交替;自由进食，NC组喂养基础饲粮，其余各组喂养高脂饲粮;每日下午3～4点进行灌胃操作，醇提物和奥利司他都溶于大豆油中，3个醇提物实验组和阳性对照组小鼠分别灌胃约0.3 mL;每3 d记录体重;饲养6周后，禁食12 h;眼球摘除取血，之后引颈处死;解剖小鼠取肾脏周围以及睾丸周围的脂肪，取小鼠肝脏，均迅速置于-80℃冰箱中保存待测。

小鼠血液取出后于室温静置2 h后置于(4～8)℃冰箱中静置过夜，10000 rpm离心10 min，取上清待测。

1.3 实验材料及仪器设备

1.3.1 基础饲粮

动物实验室普通小鼠饲粮。

1.3.2 高脂饲粮

组成为75%基础饲粮，15%猪油，10%伊利全脂奶粉。

1.3.3 马尾松花粉醇提物由本实验室制备

3.5kg的破壁马尾松花粉，乙醇三次浸提，料液比分别为:1∶10、1∶5 和 1∶5。超声 2 h，频率 26.4 kHz、提取温度50℃，搅拌转速:27 rpm。合并三次所得提取液，静置，取澄清液体。旋蒸浓缩，温度45℃，真空度0.1 MPa，直到没有乙醇味道为止。得到497 g浸膏，得率为14.2%(1g醇提物相当于7.04 g马尾松花粉)。

1.3.4 阳性对照物

奥利司他(orlistat，济南伟都化工有限公司)，HPLC纯度98.2%，溶于大豆油中。

1.3.5 试剂盒

总胆固醇(TC，CHO酶法)、甘油三酯(TG，酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC，选择性沉淀法)试剂盒均购自北京北化康泰临床试剂有限公司;脂肪因子(瘦素LEP、脂联素ADP、抵抗素Resistin)试剂盒为上海雅吉生物科技有限公司小鼠Elisa试剂盒;肉碱棕榈酰转移酶I(CPT-I)(天润生物科技有限公司代测);蛋白质定量(南京建成生物科技有限公司BCA蛋白定量法)。

1.3.6 仪器设备

GDC-TQ/ZS/4中试型多功能超声波提取及浓缩设备(济南金百特工程机械有限公司);GQ105高速管式分离机(上海浦东天本离心机械有限公司);SB1000旋转蒸发仪(EYELA);BS 124 S电子天平(Sartorius);5804 R低温离心机(Eppendorf);Stat Fax-2100酶标仪(AWARENESS);RT-1904C生化分析仪。

1.4 测定指标

测定指标包括:终体重(final weight);体重净增加(weight net increase)=实验终体重－实验初体重;体重增长率(weight gain rate)=体重增量/实验初体重×100%;体脂总重(fat content)=肾脏周围脂肪重+睾丸周围脂肪重;体脂比(rate of body fat)=体脂总重/实验末体重×100%;小鼠血清中脂质(TC、TG、HDLC)含量;小鼠血清中脂肪因子(LEP、ADP、Resistin)水平;肝脏及白色脂肪组织中肉碱棕榈酰转移酶I(CPT-I)含量。

1.5 统计方法

计算各组参数的平均值和标准偏差，采用SPSS19.0进行数据分析。

2 实验结果

2.1 小鼠体重和体脂变化

实验结束时FC组平均终体重高达51.64 g，净增重20.50 g，体重增长率高达59.29%，与NC组相比有极显著性差异(P ＜0.01)，证明肥胖模型建模成功。从表1可见，EEL、EEM和EEH组的终体重与FC组相比都有明显降低，差异极显著(P ＜0.01)，同时在体重净增加和体重增加率方面也都有明显降低(P＜0.01);3个实验组的体脂含量与FC组相比都有不同程度的降低，体脂比与FC组相比略有 升高，但无显著差异。

表1 小鼠体重和体脂变化(n=5)Table 1 Body weight and fat change of mice(n=5)

2.2 小鼠血清脂质水平变化

从表2可见，EEL组(143.47 mg/dl)和EEH组(125.55 mg/dl)与FC 组(173.97 mg/dl)相比TC 含量都明显降低，并且EEH组有极显著性差异(P＜0.01);三个实验组的TG含量与FC组相比都有明显降低，差异极显著(P＜0.01);HDLC含量与FC组相比也都有极显著升高(P＜0.01)。

表2 小鼠血清脂质水平变化(n=5)Table 2 Differences of lipid profile in mice serum(n=5)

2.3 小鼠血清脂肪因子水平变化

从表3可见，三个实验组可以升高LEP水平，与FC组相比差异不显著;ADP的含量与FC组相比都有不同程度升高，其中EEM组(89.04 ng/mL)有明显升高，差异极显著(P＜0.01);Resistin含量与FC组相比都有极显著升高(P＜0.01)。

表3 小鼠血清脂肪因子水平变化(n=5)Table 3 Adipokines change in mice serum(n=5)

2.4 肝脏和脂肪CPT-Ⅰ含量变化

从表4可见，三个实验组的肝脏和脂肪CPT-I含量与FC组相比都有明显升高，差异都具有极显著性(P ＜0.01)。

表4 肝脏和脂肪CPT-I含量变化(n=5)Table 4 CPT-I changes in mice liver and adipose tissue(n=5)

3 讨论

实验结果说明马尾松花粉醇提物在体重调节方面具有良好效果，3个醇提物实验组无论是体重增长值还是增加率与FC组相比都有显著降低;体内脂肪的堆积与FC组相比较也有明显减少。但体脂比略有升高，推测的原因可能是，本实验仅仅分离了肾脏和睾丸周围的脂肪组织，没有考虑其他脏器及皮下脂肪的堆积，从而导致比值上升。

胆固醇是人体及动物组织细胞所不可缺少的重要物质，甘油三酯是人体内含量最多的脂类，当体内胆固醇和甘油三酯积累过多时，容易形成动脉粥样硬化。实验结束时3个醇提物实验组小鼠血清中TC和TG的水平相比FC组均得到明显抑制。根据樊柏林等［4］研究证实，破壁松花粉能够通过降低血脂起到预防和控制大鼠实验性高脂血症形成的作用。同时赵霖等［3］证实，破壁松花粉可通过增加排脂起到调节机体脂代谢的作用。但与本实验不同的是这些研究采用的是破壁后松花粉的全营养成分，并没有进一步分离组分。在刘杰尔等［5］研究中采用油松松花粉醇提物，在TC和TG指标上结果趋势与本研究基本一致。有研究证实马尾松花粉脂肪酸成分中含有较高浓度的不饱和脂肪酸［6］，而不饱和脂肪酸是氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)的天然激动剂［7，8］。PPARs在体内起到提高胰岛素敏感性、调控脂肪酸代谢水平和降低体内脂质水平的作用［9］。本实验结果证实了松花粉醇提物能够促进胆固醇转运，降低甘油三酯水平。推测除去花粉壁所含的膳食纤维类物质，马尾松花粉确实含有能调节血脂代谢的成分，对于促进机体脂质代谢、预防肥胖发生，均具有重要意义。

实验中小鼠在灌胃松花粉后血清中HDLC水平也得到显著性提升。高密度脂蛋白(HDL)由肝脏合成，然后在卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT)的作用下催化HDL与游离胆固醇结合成HDLC，起输出胆固醇、促进胆固醇代谢的作用，其在体内含量的高低与动脉粥硬化的形成有关［2，3］。据医书记载松花粉具有保护肝脏的功效，能够促进肝细胞活性和解毒功能，这一点从肝脏中CPT-I酶含量得到升高可以看出，可能与松花粉含有多种维生素和矿物质有关，维生素和矿物质可以作为体内多种酶的辅酶或辅助因子促使酶行使催化功能。所以松花粉可以促进肝细胞活性，提高包括合成高密度脂蛋白在内的脂质代谢相关的酶活水平，具体调控机制需要进行相关合成酶的酶活水平的检测来进一步说明。

ADP由胰岛β细胞分泌促进血液中的葡萄糖进入肌肉或脂肪组织氧化代谢，有研究证实ADP可增强骨骼肌中脂肪酸的氧化，抑制血浆游离脂肪酸的升高，还具有抗炎、抗动脉粥样硬化的作用;LEP是由脂肪组织分泌的参与调节糖、脂肪及能量代谢的一种肽类激素，能够减少机体摄食，增加能量释放，抑制脂肪细胞合成。LEP受体基因突变可导致肥胖并引发糖尿病。3个醇提物实验组小鼠体内脂联素水平相比FC组均得到明显提升，LEP水平也有不同程度升高。从体重体脂检测结果来看，有效提升ADP和LEP水平能有效抑制肥胖形成。实验中抵抗素(Resistin)水平相比FC组也有明显提升，Steppan等［10］证实，Resistin能够促使形成胰岛素抵抗，引起高血糖症。所以提升体内Resistin的水平并不利于促进脂质代谢，对于松花粉醇提物在脂肪因子水平上的具体调控机制还有待进一步研究。

CPT-I是脂肪酸β氧化最重要的限速酶，促使脂肪酸转运至线粒体基质进行β氧化。醇提物实验组小鼠体内肝脏和脂肪的CPT-I含量相比FC组都有明显提升，甚至超过了NC组。CPT-I含量的提升对于体内脂质氧化代谢起到促进作用，从而达到减少体内脂质蓄积，进而减轻体重。

实验通过多个角度探讨了马尾松松花粉醇提物在体重调节和脂代谢调控方面的作用。结果说明松花粉醇提物在促进脂质代谢，减少脂质积累方面效果显著，可有效预防肥胖形成。为临床减肥药物的研制提供了很好的实验依据。

1 Chen Y(陈英)，Liu ZH(刘志河)，Yang FL(杨风楼)，et al.Pine pollen cold airflow smashing method.CN01115014.9.2002-08-28.

2 Sun P(孙屏)，Fan LM(范乐明).Related gene expression product of high density lipoprotein metabolism.Chin J Arter(中国动脉硬化杂志)，2006，14:543-546.

3 Zhao L(赵霖).Study of masson pine pollen on lipid metabolism in the piglet model.Acade J PLA Postgrad Med School(军医进修学院学报)，2007，27:445-447.

4 Fan BL(樊柏林)，Wang HM(王护民)，Song Y(宋毅)，et al.Study on the effect and functional mechanism of pine pollen on reducing the blood-fat level of the experimental mice.Occup Health(职业与健康)，2008，22:2012-2014.

5 Liu JE(刘杰尔).Studies on components of pine pollen and its weight control effects in vitro and in vivo.Hangzhou:Zhejiang University(浙江大学)，MSc.2008.

6 Liu H(刘辉).Determination of fatty acids in sporodermbroken pollen of Pinus massoniana by GC-MS.Chin Wild Plant Res(中国野生植物资源)，2006，25(5):57-58.

7 Kliewer SA，Sundseth SS，Jones SA，et al.Fatty acids and eicosanoids regulate gene expression through direct interactions with peroxisome proliferator-activated receptors α and γ.Proceed National Acade Sci，1997，94:4318-4323.

8 Forman BM，Chen J，Evans RM.Hypolipidemic drugs，polyunsaturated fatty acids，and eicosanoids are ligands for peroxisome proliferator-activated receptors α and δ.Proceed National Acade Sci，1997，94:4312-4317.

9 Luquet S，Gaudel C，Holst D，et al.Roles of PPAR delta in lipid absorption and metabolism:a new target for the treatment of type 2 diabetes.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease，2005，1740:313-317.

10 Steppan CM，Bailey ST，Bhat S，et al.The hormone resistin links obesity to diabetes.Nature，2001，409:307-312.