抗TRPC6多肽单克隆抗体的制备及其识别抗原表位分析①

张 萃 卢文菊 李红枝 黄超贤 王华妹 丘世龙 梅俪凡

(广东药学院微生物学与免疫学教研室，广州510006)

瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(Transient receptor potential channel，TRPC6)是瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)一个亚群，Winn等2005年首次报道TRPC6通道位于肾小球足细胞，是裂隙膜的重要组成部分，编码足细胞结构蛋白，其表达量的改变可导致大量蛋白尿，从而引起局灶节段性肾小球硬化和进行性肾衰竭［1］。随着研究的深入，在机体多个系统发现有TRPC6通道的存在，并与多种疾病关系密切，近年来成为研究热点［2，3］。测定 TRPC6的表达多在核酸水平上检测和免疫印迹法测定蛋白表达，所应用的多以TRPC6的多克隆抗体为主。基于单克隆抗体的诸多优势，本文在制备抗TRPC6多肽的单克隆抗体基础上，结合生物信息学分析单克隆抗体的表位识别特性，为进一步的TRPC6基础研究和临床检测提供新途径。

1 材料与方法

1．1 动物和细胞株 SPF级6周龄BALB/c小鼠，雌性，购自广东省医学实验动物中心，批号为SCXK(粤)2008-0002，饲养2周适应环境后用于免疫;P3-X63-Ag8．653小鼠骨髓瘤细胞系，由本室刘晓波教授赠送，购自ATCC，本室保存。

1．2 主要试剂 优级胎牛血清，购自天津市灏洋生物制品科技公司;RPMI1640培养基购自Gibco公司;HAT、HT、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自美国Sigma公司;羊抗小鼠IgG-HRP，购自Earth-Ox公司;PEG4000，购自美国Sigma公司;96孔培养板、培养瓶、酶标板均购自德国CORNING公司;TRPC6多肽合成的各种氨基酸、KLH均由上海强耀生物科技有限公司提供。

1．3 小鼠免疫及抗TRPC6多克隆抗体的检测 一次免疫3只小鼠，每次取50 μg TRPC6多肽-KLH偶联物，采取小鼠皮下多点注射法，间隔3周，第三次免疫1周后采血测其效价，选择高效价者进行加强免疫，加强免疫3天后准备细胞融合，小鼠血清保存备用。

1．4 杂交瘤细胞株的建立 按照传统单克隆抗体制备技术进行，经有限稀释法克隆化培养获得杂交瘤细胞株。并经过反复冻存、复苏后，鉴定染色体及单抗分泌稳定者建立杂交瘤细胞株。

1．5 抗TRPC6多肽单克隆抗体的特性鉴定

1．5．1 间接ELISA法检测抗体效价 以10 μg/ml包被 TRPC6多肽(1 μg/孔)，余下步骤按照间接ELISA法常规操作。

1．5．2 杂交瘤细胞株染色体鉴定 采用秋水仙素阻断法进行染色体计数。

1．5．3 单克隆抗体相对亲和力鉴定 包被TRPC6多肽(1 μg/孔)，各株单抗浓度为 100、50、25、12．5和6．25 μg/ml，37℃孵育1 小时，洗涤3 次后加入酶标二抗(1∶5 000)，37℃ 1小时后洗涤，加底物显色测定，按50%最大结合的单抗计算其相对亲和力。

1．5．4 单克隆抗体腹水制备及亚类鉴定 按常规方法取8周龄BALB/c小鼠进行腹水制备。将单抗腹水以1∶100比例开始倍比稀释，采用间接ELISA检测其反应效价。同时用HRP标记羊抗小鼠抗体亚类鉴定试剂盒对纯化腹水中单抗进行亚类鉴定。

1．5．5 小鼠脑组织总蛋白的提取及TRPC6的检测脑蛋白蛋白提取采用试剂盒(购于广州健仑生物科技有限公司);TRPC6蛋白检测采用间接ELISA法和双抗体ELISA夹心法。

1．6 单克隆抗体所识别的抗原表位分析

1．6．1 多肽设计及表位预测 应用DNAStar软件对TRPC6蛋白二级结构和表面特性(如亲水性、表面性、抗原性)等进行预测。根据预测结果先后设计一系列连续或非连续性短肽序列(见表1)，方法参考文献［4］。

1．6．2 肽段的抗原性、亲水性和线性表位预测 采用在线IEDB分析工具。

1．6．3 单抗识别抗原的位点分析 采用ELISA单抗相加试验测定。

1．7 统计学处理 数据通过 SPSS软件(16．0版本)分析，统计方法为t检验，数据用x±s表示。

2 结果

2．1 TRPC6多肽单抗的制备与鉴定

2．1．1 免疫原的制备 经过多肽设计与筛选，获得P5(KDLTKVTLGDNVKYY)序列，合成多肽，经 MS分析所合成多肽的相对分子质量测定值1 757．03，HPLC分析其纯度＞98%。HPLC结果如表2。用合成肽与血蓝蛋白KLH偶联后，作为免疫原备用。

2．1．2 杂交瘤细胞株的建立 经过3次常规小鼠免疫，一次加强免疫后，进行细胞融合和4次亚克隆，最终获得3株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株，分别命名为A2、H8和F11。经过反复冻存与复苏，传代半年以上分泌单抗稳定。

2．1．3 单抗腹水效价测定及其亚类鉴定 常规制备腹水，以合成肽为抗原，将腹水按1∶100开始做倍比稀释，ELISA方法测定其效价在1∶6 400以上。利用单抗亚型鉴定试剂盒对所建立的3株单抗进行亚型鉴定，结果显示3株单抗均为IgG1，轻链均为κ链。

表1 P1～P5的氨基酸序列、长度和位置Tab．1 Sequence，size and location of peptide in P1-P5

表2 P5的HPLC分析Tab．2 HPLC analysis of sequence 5

2．1．4 杂交瘤细胞系染色体分析 通过秋水仙素阻断法进行染色体计数统计分析，3株杂交瘤细胞的染色体数目相对稳定，由于小鼠骨髓瘤细胞Ag8.653的染色体数为49±7，小鼠体细胞数为40±7，因而杂交瘤细胞的染色体数平均为86±7，细胞中绝大部分染色体为端部着丝点，结果见图1。

2．1．5 单抗相对亲和力测定分析 以纯化后的腹水采用ELISA方法测定已知浓度的3株单抗，按达到50%最大结合的单抗浓度分析相对亲和性，亲和力越大，所需抗体浓度越低。结果3株单抗达到50%最大结合浓度:A2 和H8 均为12．5 μg/ml，F11为6 μg/ml，因此，相对亲和力 A2和 H8相近，而F11较强。

2．1．6 单抗特异性检测TRPC6蛋白 通过间接ELISA检测三株单抗均能与小鼠脑组织蛋白发生特异性结合，共检测了10个样本，平均值为(1．020±0．034)μg/ml，与正常小鼠血清对照(0.101 ±0.003)μg/ml相比，P 值 ＜0．05，结果有显著性差异，说明单抗具有良好的特异性。

进一步采用双抗体ELISA夹心法检测小鼠和大鼠脑蛋白，验证单抗特异性结合TRPC6蛋白的作用，同样各自测定10个样本，小鼠为(0．82±0.02)μg/ml，大鼠为(1．22 ±0．05)μg/ml，结果表明所制备的单抗具有与TRPC6蛋白特异性结合的特性。

图1 3株杂交瘤细胞染色体镜下观察(姬姆萨染色，×1 000)Fig．1 Chromosome image of three screening hybridoma cells(Giemsa，×1 000)

图2 P1～P5在人类TRPC6蛋白序列上的位置Fig．2 The location of P1-P5 in human TRPC6 protein

2．2 单抗识别抗原表位的初步鉴定

2．2．1 肽段氨基酸分布及特性预测

2．2．1．1 TRPC6合成肽序列筛选 根据抗原多肽设计原则对TRPC6合成多肽序列进行筛选，一般选择15个氨基酸的长度较为容易合成纯度高的多肽，还要避开TRPC6分子的胞内段。所以要通过IEDB Analysis Recource提供的蛋白质抗原表位在线分析工具进行预测，根据表露性区域初步筛选出5段TRPC6分子肽段，分别为 P1、P2、P3、P4和 P5(见表1)。同时要求所选肽段在人与小鼠中均为保守序列，人与鼠的同源性为88%(2 563/2 903)，人类TRPC6分子蛋白序列分布比对结果见图2。

2．2．1．2 TRPC6合成肽段筛选结果 在以上序列设计的基础上，分别预测上述5个肽段氨基酸序列的抗原性、亲水性及线性表位，初步筛选出P序列5-KDLTKVTLGDNVKYY为本实验目的序列，再进一步应用Parker法对P5的亲水性进行分析以及利用DNAstar蛋白分析软件进一步分析确认P5的以上特性，结果最终确定P5为合成肽序列，预测结果见表3。

2．2．2 单抗识别抗原的位点分析 在以上生物信息学预测各种特性基础上，采用ELISA单抗相加试验对抗体识别位点的差异进行分析，单抗A2与H8、A2与F11的相加指数分别为51%和60%，大于50%说明可能为识别不同位点;而F11与H8的相加指数为18%，小于50%，可能为识别的同一位点。为了进一步验证实验的重复性，经过三次重复实验，变异系数为1．09% ～9．88%，变异系数 ＜10%，说明离散程度不高，且重复性良好，结果见表4。

表3 TRPC6合成肽的抗原性、亲水性和线性表位预测Tab．3 The sequence selection，antigenicity，hydrophilicity and epitope prediction of TRPC6 peptide sequence

表4 3株单克隆抗体相加指数和表位分析Tab．4 Additivity index and epitope analysis of three monoclone antibody

3 讨论

抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，抗原通过表位与相应抗体特异性结合，从而引发免疫应答。本实验综合运用多个生物信息学软件对TRPC6蛋白进行表位预测，初步筛选出了符合要求的肽段(P5)作为免疫肽，合成后通过HPLC对多肽进行的纯度分析显示，所合成多肽的纯度在98%以上，符合免疫动物要求。运用MS对合成多肽进行分子质量的测定结果显示多肽的相对分子质量测定值与理论值相符合，以此确保了所合成的多肽与KLH偶联后可作为目的抗原进行免疫。实验中所获得的单抗通过测定抗体亲和力结果，进一步验证了多肽P5与单抗的结合力，说明生物信息学软件对抗原表位预测的可行性［5］。此外，在对单抗识别位点分析中，若两株单抗的相加指数＞50%，说明可能是针对不同识别位点的抗体;若＜50%可能是针对同一识别位点的抗体，由此获得A2与H8配对较好，为进一步ELISA方法学的建立提供条件。

在单克隆抗体鉴定过程中，亲和力和特异性的测定很重要。抗体亲和力测定方法很多，之所以选择ELISA方法测定单抗相对亲和力，是因为具有敏感性高、重复性好和方便快捷等优点。此外，对于用于临床诊断和治疗上的单抗，选择的原则应是在保持高度特异性的前提下选用亲和力强的单抗［6］。通过以上实验获得的3株单抗中F11亲和力较强，可用于下一步的免疫标记实验;进一步对单抗的特异性测定结果表明，所制备的单抗均可以与小鼠和大鼠脑蛋白中的TRPC6结合。因目前尚无标准TRPC6蛋白做对照，而早期研究该蛋白大量分布于神经系统中［7］，所以实验中初步利用小鼠和大鼠的脑蛋白组织进行测定验证，结果表明3株单抗均具有与天然TRPC6结合的生物学特性。通过以上研究，抗TRPC6多肽单克隆抗体的制备与表位分析，将为今后的免疫学方法构建打下良好的实验基础。

1 Winn M P，Conlon P J，Lynn K L et al．A mutation in the trpc6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis［J］．Science，2005;308(5729):1801-1804．

2 Dietrich A，Gudermann T．TRPC6［J］．Handb Exp Pharmacol，2007;179(1):125-141．

3 刘若飞，张 萃．瞬时受体电位阳离子通道6作为疾病治疗靶点研究进展［J］．国际药学研究杂志，2012;39(6):474-477．

4 张 萃，梅俪凡，卢文菊 et al．瞬时受体电位阳离子通道蛋白6合成肽的设计与合成［J］．广东药学院学报，2011;27(5):514-517．

5 曹 凯，黄 路，林治华et al．分子模拟用于尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2．1限制性CTL表位的筛选［J］．化学学报，2010;68(13)1277-1284．

6 都春海，陈远雄．单克隆抗体相对亲和力和特异性的测定［J］．中国免疫学杂志，1986;2(5):262-265．

7 崔龙彪，金晓航，史 娟．中枢神经系统内的TRPC6离子通道［J］．神经解剖学杂志，2011;27(5):565-570．