聚丙烯酰胺凝胶电泳分离恶性疟原虫pfs25膜蛋白的免疫原性研究

陈 勇 李 萍 张予超 雷 清 蒋 琳

(国药集团兰州生物制品研究所有限责任公司，兰州730046)

疟疾是通过蚊叮咬传播的寄生虫病，其病原体为疟原虫。pfs25蛋白质是位于恶性疟原虫子孢子囊表面的膜蛋白，该蛋白质在实验动物体内诱导产生抗体以阻断动合子的形成，是传播阻断型疟疾疫苗的候选靶抗原。美国NIH以pfs25蛋白质作为抗原制备的疫苗已经完成I期临床试验。

制备针对pfs25蛋白质的单克隆抗体，进而建立ELISA检测方法是研制基于pfs25蛋白的阻断型疟疾疫苗所必需的。本研究中，作者尝试用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的方式获得pfs25蛋白纯品，免疫小鼠。用荧光光谱分析、酶联免疫吸附实验，分析了纯化过程中，pfs25蛋白的构像与免疫原性间的关系，并对引起免疫原性改变的原因进行了初步的探讨。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器 标准蛋白质分子量购自GE公司。抗pfs25单克隆抗体4B7和标准pfs25蛋白由美国MR4惠赠;HRP标记兔抗鼠IgG购自Sigma公司;pfs25/pGAPZαA/GS115重组酵母菌为本室构建;多功能酶标仪Spectra Max M2e(MD公司)。硫酸铵及其它试剂为进口或国产分析纯。

1．2 实验方法

1．2．1 pfs25/pGAPZαA/GS115 重组酵母菌表达pfs25蛋白质［1］挑取阳性酵母重组菌 pfs25/pGAPZαA/GS115转接到3 ml BMGY液体培养基中，20 ml三角瓶，30℃、250 r/min摇床培养，每隔24小时取样，8 000 r/min离心 3分钟，取上清－20℃保存。目的基因表达时间截止到96小时。阴性对照菌株pGAPZαA/GS115同步培养并留样。

1．2．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化pfs25蛋白质及小鼠免疫 用6 000 r/min，15分钟离心重组菌的培养液，收集上清，加入硫酸铵至80%饱和度，4℃盐析，12小时。8 000 r/min，30分钟离心收集沉淀的蛋白质，进行常规SDS-PAGE制备电泳，分离胶的浓度为10%，浓缩胶的浓度为5%，考马斯亮蓝染色。刀片切除目的蛋白质条带，捣碎后加到垂直电泳管中。以50 mmol/L Tris-HCl，pH7．4 作为电泳缓冲液，120V电泳2小时。将纯化的pfs25蛋白质，以2．5 μg/只的剂量接种NIH小鼠，免疫程序:0、2、4周。

1．2．3 间接ELISA 三针免疫后一个月采集小鼠血样，用间接 ELISA检测血清抗体。即用 0．1 mol/L(pH9．6)的碳酸氢钠缓冲液10倍稀释小鼠血清后，4℃过夜;以含20%牛血清的0．02 mol/L PBS 37℃封闭1小时;依次加入pfs25单抗4B7、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG，其它按常规操作。TMB显色后终止反应，用酶标仪测其450 nm/630 nm双波长OD值。

1．2．4 双抗体夹心 ELISA［2］在用 2 μg/ml 的pfs25单抗4B7包被板中，加入电泳纯化的pfs25蛋白，浓度为 1．0 μg/ml，37℃，1．5 小时;洗板后，加入2 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记pfs25单抗1B4作为二抗，37℃反应1小时;洗板后，TMB显色后终止反应，用酶标仪测其450 nm/630 nm双波长OD值。1．2．5 荧光光谱实验 用 pH7．4，50 mmol/L Tris-HCl溶解pfs25标准蛋白和电泳纯化的pfs25蛋白，浓度为0．1 mg/ml。用多功能酶标仪将以上两种pfs25蛋白质样品进行荧光光谱测定，以280 nm的激发光激发，记录样品在300～550 nm之间的发射光谱。

2 结果

2．1 聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化pfs25蛋白质 首先按照文献［1］成功地进行了pfs25重组蛋白的表达，对表达的培养基上清进行80%饱和度硫酸铵沉淀后，pfs25蛋白得到了有效的浓缩。通过凝胶电泳纯化后，获得了纯度为93%的pfs25蛋白质纯品，结果见图1。

2．2 ELISA分析 采用双抗体夹心ELISA方法分析了电泳纯化的pfs25蛋白。图2的结果表明，电泳纯化的pfs25蛋白与抗体呈明显的阳性反应，这证明了制备电泳的纯化方式保留了该蛋白的抗原性。采用了间接ELISA方法分析了pfs25免疫小鼠的血清抗体效价，在对受试小鼠血清稀释10倍后，ELISA结果阴性(结果未列)。这说明经过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化pfs25蛋白质已经丧失了其免疫原性。

图1 SDS-PAGE分析重组pfs25蛋白质Fig．1 Analysis of recombinant pfs25 protein by SDS-PAGE

图2 双抗体夹心ELISA检测电泳纯化的pfs25蛋白Fig．2 Isolated pfs25 protein was identified by ELISA

图3 pfs25蛋白质在280 nm激发波长的荧光光谱Fig．3 Fluorescence emission spectra of pfs25 protein excited at 280 nm

2．3 荧光光谱 对pfs25标准品和经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的pfs25蛋白质同时进行荧光光谱分析。如图3所示，pfs25标准品在25℃时，自身荧光强度最高。凝胶纯化电泳的pfs25蛋白质荧光响应，60℃时高于120℃，表现出对温度的负相关。同时也可以看到，由这两种蛋白质制备的三个样品，均在320～350 nm之间存在最高的荧光信号。

3 讨论

聚丙烯酰胺凝胶电泳是在上世纪六十年代应用于蛋白质研究，是一种常用的蛋白质分析技术。但在单克隆抗体制备或生物药物研发的早期摸索阶段，尤其是抗原来源困难的情况下，利用SDS-PAGE电泳作为蛋白质纯化手段，已在很多研究中得到应用［3-6］，这主要是利用了电泳纯化目标蛋白质的快速、简便和有效的特点。但是，该方法的最大缺陷就是操作过程中造成的目标蛋白的变性。所以，该方法仅适合化学性质稳定的蛋白质。

蛋白质分子中能发射荧光的三种氨基酸残基为色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。其中，Trp在280～290 nm的激发光下，发射的荧光强度最大。本研究中的目标蛋白质pfs25，由171个氨基酸组成，其中，不含有Trp，仅含3个 Tyr和3个Phe。能够产生荧光的氨基酸仅占pfs25蛋白总体的3．5%(6/171)，若按照20种氨基酸的平均组成计算，3种氨基酸(Trp、Tyr和 Phe)应该有:3 ×(171 × 0．05)=25．65个，显然，pfs25蛋白是一种自身产生荧光很弱的蛋白质。由于该蛋白的一级序列中不存在荧光强度最大的色氨酸，就造成了该蛋白在280 nm处荧光强度很低，即在荧光光谱分析中标准pfs25的荧光强度也达不到200单位。此外，该蛋白质虽然不大，但在三维结构上，却包含9对二硫键，四个“EGF样结构域”。以上结构组成使得pfs25蛋白质的三级结构极为致密，肽链的扭曲程度高。通过SWISS-MODEL软件模拟的pfs25蛋白的空间结构分析，可以看出多数酪氨酸和苯丙氨酸位于分析内部的疏水区域，这样的分布有利于稳定荧光生色基团。而通过电泳纯化后的pfs25蛋白质中，空间分子结构趋于解离，这造成荧光产生氨基酸受到保护的疏水区域被破坏，使得酪氨酸和苯丙氨酸过多地暴露在溶剂中，降低了荧光强度。从荧光光谱分析中也可以看出，电泳纯化的pfs25蛋白在经过了120℃的加热处理后，荧光强度仅为标准品的30%。

本研究中，经电泳分离的毕赤酵母重组表达的pfs25蛋白质免疫小鼠后，受试动物没有获得预期的免疫效果，小鼠血清抗体阴性。初步认为:经过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化pfs25蛋白质虽保留了原蛋白的抗原的反应性，但丧失了免疫原性。对此，作者认为在电泳纯化pfs25蛋白质的样品制备过程时，加热和SDS的理化作用导致了该蛋白质结构改变和表位的破坏，丧失了其免疫原性。Wu的研究也表明［7］，天然pfs25蛋白自身的免疫原性就不强，也从侧面证实了电泳分离的pfs25蛋白可能丧失免疫原性。

不同的蛋白质抗原，因性质差异在理化处理后可能对其免疫原性有不同的影响。在经过同样的高温处理后的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，前者的免疫原性完全丧失，而β-伴大豆球蛋白的免疫原性却仅是稍微下降［8］。可见蛋白质的免疫原性对蛋白质的结构特征有很强的要求，尤其是空间构像。此外，抗全长 Tat蛋白血清可以与艾滋病毒Tat蛋白N末端合成肽反应性，并非所有含N末端的 Tat抗原都能够诱导抗该区抗体［9］。同时，免疫原性是在整体动物水平进行的，影响实验的因素大为增加。而对于蛋白质的抗原性，只要保持与特异性抗体反应的氨基酸组成，ELISA检测多表现为阳性结果。况且，抗原性的检测通常是在体外进行，反应的可控性强，干扰因素较少。

1 陈 勇，雷 清，刘 晓et al 恶性疟原虫膜蛋白Pfs25在毕赤酵母中的组成型表达［J］ 生物技术通讯，2011;22(6):785-788．

2 李 萍，马亚茹，陆 俭et al．Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立［J］．细胞与分子免疫学杂志，2011;27(12):1330-1334．

3 时永全，韩者艺，王 新et al．利用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的微量蛋白制备抗血清［J］．细胞与分子免疫学杂志，2002;18(6):621-623．

4 石丽媛，杨光璨，董珊珊 et al．SDS-PAGE制备凝胶纯化鼠疫菌Pla蛋白［J］．医学动物防治，2008;24(12):906-907．

5 蔡 瑜，向本春，席德慧et al．苹果褪绿叶斑病毒库尔勒分离物外壳蛋白基因的克隆、原核表达及特异抗血清的制备［J］．农业生物技术学报，2005;13(4):533-537．

6 Guinee P A M，Jansen W H，Agterberg C M．Detection of the K99 antigen by means of agglutination and immunoelectrophoresis in Escherichia coli isolates from calves and its correlation with enterotoxigenicity［J］Infection and Immunity，1976;13(5):1369-1377．

7 Yimin Wu，Ellis R D，Donna Shaffer et al．Phase 1 trial of malaria transmission blocking vaccine candidates Pfs25 and Pvs25 formulated with montanide ISA 51［J］．PLoS ONE，2008;3(7):e2636．

8 孙 鹏，秦贵信．蒸汽处理对纯化大豆抗原含量及免疫原性的影响［J］．中国兽医学报，2006;26(5):551-554．

9 张华群，廖文婷，陈秋莉et al．人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白N末端缺失突变体融合蛋白的表达及其免疫原性分析［J］．病毒学报，2011;27(6):580-586．