利用SUMO表达系统高效可溶表达人白细胞介素15及其活性研究

白福良 田 辉 牛泽杉 于引航 王文飞 周 兵 李德山

(东北农业大学生命科学学院生物制药教研室，哈尔滨150030)

白细胞介素15(IL-15)是1994年 Grabstein等［1］发现的一种新的细胞因子，可由活化的单核-巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生［2］。IL-15前体分子由162个氨基酸组成，先导序列较长为48个氨基酸残基，成熟分子114个氨基酸残基，分子量14～15 kD。IL-15具有类似IL-2的结构和功能，可刺激CTLL细胞和PHA活化T细胞(CD4+和CD8+亚群)的增殖、诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)和淋巴因子激活杀伤细胞(Lymphokine-activated killer cells，LAK)的产生［3，4］。

IL-15有广泛的生物学活性，在人体多种组织细胞中，分布广泛，在机体免疫/炎症性疾病如类风湿性关节炎、炎症性肠疾病以及超敏反应的发病过程中起重要作用，而且IL-15是一个重要的抗肿瘤因子，在机体荷瘤状态下具有免疫调节作用［5］。

本实验利用pSUMO Vector原核表达载体，高效且可溶表达hIL-15蛋白。以往以非融合标签的形式表达hIL-15需经多步层析纯化后才能达到较高纯度的蛋白，操作步骤较繁琐。本实验克隆并以融合标签的形式表达了hIL-15，其主要以可溶形式表达，并可以通过二步亲和层析获得较高纯度的蛋白，由此方法得到的蛋白活性较好。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 菌株和细胞株 Trans2-Blue化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;DH5α、Rosetta由本实验室保存;HepG2和H22细胞株由本实验室保存;B16-F10细胞株由厦门大学韩家淮实验室馈赠。

1．1．2 克隆和表达载体 pMD18-T vector购自TaKaRa公司;pSUMO Vector由本实验室保存。酶及生化试剂:TaqDNA聚合酶、BamHⅠ购自TaKaRa公司;T4 DNA Ligase、BsaⅠ限制性内切酶购自New England BioLabs公司;SUMO蛋白酶由本实验室保存。Reverse Transcriptase、RI、oligod(T)-18primer和Trizon购自Invitrogen公司;质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司;胶回收试剂盒购自QIAGEN公司。

1．1．3 引物设计与合成 由Invitrogen公司合成。构建克隆 hIL-15引物:SenseprimerP1:5'-TGAGAATTTCGAAACCACA-3'下划线为BsaⅠ切割位点;Antisense primer P2:5'-CG-TTAAAGAAGTGTTGATGAACATTTGG-3'下划线为BamHⅠ切割位点。

1．1．4 实验动物 昆明种小鼠，雄性，体重(20±1)g，由哈尔滨兽医研究所提供。

1．2 实验方法

1．2．1 人外周血淋巴细胞的分离、mRNA的提取和cDNA的合成 使用常规方法分离人外周血淋巴细胞，Trizon试剂裂解淋巴细胞，酚氯仿(1∶3)进行抽提，得到mRNA进行反转录，合成cDNA。

1．2．2 rpSUMOhIL-15的表达载体的构建 以合成cDNA为模板，以 P1、P2为引物进行 PCR，得到的PCR产物与pMD18-T vector连接，转化Trans2-Blue化学感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定正确后，由生工生物工程(上海)有限公司进行测序。将测序后与GenBank公布的序列完全相同的质粒使用BamHⅠ和 BsaⅠ进行酶切，连入 pSUMO Vector，转化Trans2-Blue化学感受态细胞，提取质粒并鉴定，构建出rpSUMOhIL-15的表达载体。

1．2．3 工程菌的诱导表达 转化大肠杆菌(DH5α，Rosetta)化学感受态细胞，经过活化后转接入500 ml培养瓶中，37℃培养至OD600值为0．3～0．4 时加入终浓度为0．25 mmol/ml的 IPTG，37℃诱导4个小时后，离心、收集菌液。

1．2．4 rhIL-15的纯化 取 rpSUMOhIL-15转化菌大量诱导表达hIL-15，诱导后的菌体用Lysis buffer(10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8．0)重悬后，加入溶菌酶至终浓度为1 g/L，冰上放置30分钟后超声破碎，12 000 r/min离心30分钟，收集上清。上清液利用AKTA purifier 100系统经过 His TrapTMFF crude亲和层析，用Wash buffer(20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8．0)洗去杂蛋白后，再用Elution buffer(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaH2PO4，pH8．0)洗脱，收集唯一的洗脱峰即为融合蛋白。收集的融合蛋白脱盐后，加入SUMO Protease和终浓度2 mmol/L的 DTT，30℃切割1小时，再经Ni-NTA柱亲和层析，收集流出液进行SDS-PAGE电泳检测。

1．2．5 高效液相色谱HPLC柱层析对目的蛋白的纯度分析 将上述得到的rhIL-15成熟蛋白进行高效液相色谱HPLC柱层析，分析目的蛋白的纯度。

1．2．6 rhIL-15成熟蛋白的生物活性分析 培养CTLL2细胞，调细胞浓度为1×105ml－1，加入 rhIL-15终浓度为100 ng/ml，设置对照组，观察CTLL2细胞增殖情况。以CTLL2的增殖指数为1，MTT法测定其他组细胞的增殖指数。

常规分离人外周血单核细胞，用RPMI1640调细胞浓度为1×106ml－1，加入rhIL-15终浓度为100 ng/ml，同时设对照组。培养144小时诱生的LAK细胞作为效应细胞，HepG2和B16-F10细胞为靶细胞，同时设置对照组，设定效靶比 100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1，每组设置3 个平行样，MTT 法测定LAK细胞对HepG2和B16-F10细胞的杀伤活性。

1．2．7 昆明小鼠H22肝癌动物模型建立 将H22小鼠肝癌细胞于昆明小鼠腹腔接种，7天后断颈处死小鼠。无菌条件下抽取腹水，稀释成1×106ml－1，每只小鼠右侧腹股沟皮下注入 100 μl。7 ～10天后皮下形成实体瘤。

2 结果

2．1 pMD18-T-IL-15的构建和鉴定 以cDNA为模板，加入P1、P2 两种引物，10 ×PCR buffer、rTaq酶和水进行PCR，扩增出一条大约500 bp的特异性目的条带，与预期的492 bp大小相符，初步确认为hIL-15片段。对产物进行回收后，与pMD18-T-vector连接，转化Trans2-Blue化学感受态细胞，提取质粒，构建出rhpMD18-T-IL-15质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和BsaⅠ进行双酶切鉴定，得到约2 700 bp和500 bp的条带，与预期的2 694 bp和492 bp目的条带大小相符，如图1所示:经测序后，测序结果与Gene-Bank［7］上的序列完全一致，确定重组质粒pMD18-TIL-15完全正确。

2．2 rpSUMO Vector-IL-15的构建和鉴定 用BamHⅠ和BsaⅠ对重组质粒pMD18-T-IL-15进行双酶切，回收目的产物后与pSUMO Vector连接，转化Trans2-Blue化学感受态细胞提取质粒，构建出重组pSUMOhIL-15质粒。将挑取的单菌落采用菌液PCR鉴定目的基因是否连入pSUMO Vector中。对初步鉴定正确的单菌落提取质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和BsaⅠ进行酶切鉴定，如图2所示，得到约5 700 bp和500 bp的条带，与预期的条带大小相符。

2．3 目的蛋白的表达和纯化 将重组质粒rpSUMOhIL-15转化大肠杆菌(DH5α，Rosetta)化学感受态细胞，转接入 500 ml培养瓶中，37℃培养至OD600值为0．3～0．4时进行诱导目的蛋白的表达。在37℃，IPTG浓度为0．25 mmol/L的条件下诱导表达，分别取未诱导和诱导时间分别为 2、2．5、3、3．5、4小时菌液的上清和沉淀于12%分离胶进行SDSPAGE分析，确定最佳的诱导时间为4小时，而且发现目的蛋白以融合蛋白的形式于上清中表达。

图1 pMD18-T-IL-15的酶切鉴定Fig．1 Restriction enzyme analysis of pMD18-T-IL-15

收集的菌液经过超声破碎、过滤后加入到预先Washing buffer平衡好的亲和层析柱中，使用AKAT purifier 100蛋白自动纯化系统进行纯化。经过亲和层析、Washing buffer除杂质、Elusion buffer洗脱目的蛋白、目的蛋白脱盐后得到较纯的rpSUMOhIL-15蛋白。通过将阳性诱导菌株的表达蛋白薄层扫描图与含空载体的诱导菌株的表达蛋白薄层扫描图进行对比，可以得出融合蛋白表达量约占宿主细胞中总蛋白质量的33%，已属高效表达范畴。

图2 pSUMO Vector-IL-15的PCR和酶切鉴定Fig．2 Restriction enzyme and PCR analysis of pSUMO Vector-IL-15

图3 SDS-PAGE分析Fig．3 Assay by SDS-PAGE

上柱前、脱盐后和SUMO蛋白酶切后的蛋白在15%分离胶进行SDS-PAGE分析，如图3所示，从图中可以看出已获得成熟rhIL-15蛋白。

2．4 高效液相色谱HPLC柱层析分析目的蛋白的纯度 将上述得到的rhIL-15成熟蛋白进行高效液相色谱HPLC柱层析，分析目的蛋白的纯度，如图4所示，可以看出目的蛋白的纯度在95%以上，属于高纯度范畴。

图4 高效液相色谱HPLC柱层析分析目的蛋白的纯度Fig．4 Purity of purpose protein was analyzed by HPLC(High Performance Liquid Chromatography)

图5 rhIL-15促进CTLL2增殖Fig．5 rhIL-15 stimulated proliferation of CTLL2 cells

2．5 rhIL-15成熟蛋白的活性检测 浓度为1×105ml－1CTLL2细胞中加入终浓度为100 ng/ml rhIL-15，对照组分别加入转化空质粒且采用同样方法处理相同体积的洗脱液、相同体积的生理盐水。培养24小时后，MTT法检测细胞增殖情况。结果显示，与对照组相比(对照组增殖指数为1)，rhIL-15可以明显刺激CTLL2细胞的增殖，维持CTLL2细胞的正常生长(P＜0．01)，结果如图5所示。

图6 rhIL-15活化的NK细胞对B16-F10和 HepG2细胞的杀伤效应Fig．6 NK cells activated by rhIL-15 against B16-F10 and HepG2cells

图7 PBS和rhIL-15治疗组荷瘤鼠模型肿瘤体积变化及均值比较Fig．7 Tumor growth of tumor-bearing mouse model treated with PBS or rhIL-15 and mean value of two groups tumor volume

rhIL-15诱生的LAK细胞作为效应细胞，HepG2细胞和B16-F10细胞为靶细胞，MTT法测定LAK细胞对HepG2和B16-F10细胞的杀伤作用。如图6所示，与对照组相比较，rhIL-15诱生的LAK细胞对HepG2和B16-F10细胞具有显著的杀伤作用(P＜0．01)。在效靶比为 100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1时，杀伤活性随效靶比的下降而降低没有经过rhIL-15诱生的淋巴细胞对HepG2细胞和B16-F10细胞的杀伤活性很低。

2．6 rhIL-15对昆明小鼠H22肝癌动物模型的抑制荷瘤鼠肿瘤直径达到5～8 mm开始治疗，将实验动物随机分为2组，每组5只小鼠，分别静脉注射50 μl PBS和rhIL-15(100 ng)每2天一次，连续治疗4次，隔天测量一次肿瘤直径，应用公式:V=4/3×π×r3，计算肿瘤体积(其中r表示肿瘤直径的平均值)。如图7所示，PBS治疗组，治疗前肿瘤平均体积为 614．3411 mm3，治疗后平均体积为3 254．368 mm3，肿瘤体积显著增加。rhIL-15治疗组，治疗前肿瘤平均体积为476．488 7 mm3，治疗后平均体积为67．101 57 mm3，肿瘤体积明显减小。

3 讨论

近年来的研究表明SUMO蛋白作为一个高度疏水的核心为目的蛋白的折叠提供成核位点，以其作为分子伴侣可促进外源蛋白正确折叠，增强了融合蛋白的可溶性［8，9］。

本研究利用pSUMO Vector原核表达系统高效、可溶性地表达hIL-15蛋白，在最佳表达条件下，该载体表达人hIL-15蛋白，表达量达到了菌体总蛋白的33%，说明目的蛋白获得了高效表达。在研究过程中通过自主构建和修饰的pSUMO Vector原核表达载体与SUMO蛋白酶，解决了融合蛋白表达的两大关键性技术问题:一是表达外源蛋白的溶解性问题。通过在表达载体中引入SUMO融合标签显著提高了外源蛋白的可溶性表达水平，促进其正确折叠，保证其生物学活性。二是融合标签的去除问题。本研究通过SUMO蛋白酶-Ⅰ对目标蛋白和融合标签进行分离，并且由于融合标签和蛋白酶［10］都具有组氨酸标记，在通过层析柱时两者均可被吸附，达到一次洗脱目的蛋白的效果，不仅得到的蛋白纯度较高，而且大大节约了研究的时间和成本。

在研究中对纯化的rhIL-15生物活性进行研究。纯化后的rhIL-15可以诱导CTLL2细胞的增殖，大大增强rhIL-15诱生的LAK细胞对B16-F10和HepG2 细胞的杀伤活性，与文献报道一致［11，12］。LAK细胞被认为是非特异性细胞免疫治疗的主要功能细胞，动物体内实验和人体试用均显示出抗感染、抗肿瘤的疗效［13，14］。本实验发现 rhIL-15 能上调LAK杀伤活性，对H22荷瘤鼠模型肿瘤具有明显的治疗效果，这不仅在开发LAK细胞用于过继免疫治疗上有实际应用价值，而且为rhIL-15的临床应用奠定基础。

综上，在外源蛋白的表达水平、产物的可溶性和生物学活性方面pSUMO Vector表达系统优于其他的原核表达系统，是表达目的蛋白的理想工具。本实验利用SUMO表达系统高效可溶性表达人白细胞介素15，并且获得了高纯度高活性的rhIL-15，动物实验结果也表明获得的rhIL-15具有抗肿瘤效果，为今后本实验室进一步研究rhIL-15的功能奠定了基础。

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