登革2型病毒体外诱导Ana-1巨噬细胞极化及其TLR7表达的研究①

龙世棋 商正玲 左 丽 (贵阳医学院免疫学教研室，贵阳550004)

登革病毒(Dengue virus，DEN)是单股正链RNA病毒，由于缺乏有效的治疗手段，DEN感染已成为威胁人类健康的全球性公共安全问题。DEN致病与病毒毒力和机体免疫功能有关［1］，但确切的机制尚不明确。巨噬细胞是重要的固有免疫细胞，也是DEN感染的重要靶细胞［2，3］。近年来研究发现巨噬细胞并不是功能单一的细胞，根据活化状态和功能的不同可将其分为M1型即经典活化的巨噬细胞和M2型即替代性活化的巨噬细胞［4，5］。巨噬细胞表达多种模式识别受体，Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是天然免疫中重要的模式识别受体，在机体抗病原体感染中发挥重要的作用。其中，TLR7可识别病毒ssRNA，经病毒ssRNA刺激的TLR7启动MyD88依赖的信号通路，诱导促炎症细胞因子释放，因而在介导抗病毒免疫中发挥重要的作用［6，7］。本研究拟用小鼠Ana-1巨噬细胞系作为实验对象，探讨DEN2诱导巨噬细胞极化及其TLR7表达的情况，为DEN致病机制的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞株 登革2型病毒NGC株，为本室保藏，常规方法增殖病毒，根据Reed-Muench法测定半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose，TCID50)为 10-6.33/100 μl。小鼠骨髓来源巨噬细胞系(Ana-1)，由本室保藏。

1.1.2 主要试剂 改良型RPMI1640培养液购自Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;rmIFN-γ、rmIL-4购自 Cytolab公司;LPS购自Sigma公司;Trizol购自大连宝生物工程有限公司;逆转录试剂盒和Real-time PCR试剂盒购自Invitrogen公司;兔抗鼠诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、精氨酸酶 1(Arginase 1，Arg-1)多克隆抗体购自Santa Cruz公司;兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗体购自Abcam公司;HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自Abmart公司;Mouse TNF-α ELISA试剂盒购自eBioscience公司;硝酸纤维膜素购自Millipore公司;BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司;ECL化学发光试剂盒购自Pierce公司。

1.1.3 引物设计 引物采用Primer Premier 5.0软件设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 取对数生长期的Ana-1细胞以5×105/孔接入6孔培养板;病毒感染组:DEN2感染复数(MOI)为1;M1型极化对照组:以rmIFN-γ(终浓度100 U/ml)+LPS(终浓度10 ng/ml)诱导细胞M1型极化;M2型极化对照组:以rmIL-4(终浓度10 U/ml)诱导细胞M2型极化［8］;正常对照组:加入细胞维持液 2 ml。分别收集各组 24、72、120小时Ana-1细胞及培养上清做后续检测。

1.2.2 直接免疫荧光法检测病毒抗原 常规方法处理细胞，兔血清室温封闭60分钟，用FITC标记的兔抗DEN2抗体室温孵育1小时，PBS洗涤后于荧光显微镜下用波长488 nm的激发光观察FITC标记的荧光并摄取图像。

1.2.3 细胞总RNA的提取和逆转录 收集细胞，加入1 ml Trizol试剂，混匀，按试剂操作说明书提取细胞总RNA。取2 μg总RNA为模板，以寡核苷酸Oligo(dT)为引物，体系25 μl，按反转录试剂盒说明书进行反转录。RNA及 cDNA分别于 -80℃和-20℃ 保存备用。

1.2.4 细胞总蛋白提取 常规方法提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，-70℃保存备用。

表1 PCR引物核酸序列Tab．1 The primer sequence for PCR

1.2.5 荧光定量PCR检测 利用基因引物加荧光染色复合物SYBR Green mix进行RT-PCR检测。总反应体系为 25 μl:其中 SYBR Green mix 12.5 μl，上下游引物各 0.5 μl，模板 cDNA 50 ng，ddH2O 补足至25 μl。循环参数为94℃预变性2分钟;一个循环94℃ 30秒，64℃ 30秒;35个循环扩增。记录Ct值并计算 2-△△Ct。

1.2.6 Western蛋白印迹分析 将变性的总蛋白50 μg经 12%SDS-PAGE 电泳，再以 0.8 mA/cm2恒流转印至NC膜。用含5%脱脂牛奶的封闭液封闭1小时，再分别用相应的兔抗鼠iNOS(1∶1 000)、Arg-1(1∶1 000)、TLR7(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)抗体4℃孵育过夜。次日PBST洗涤，用HRP标记的羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃孵育2小时，ECL显色系统定影显色，读取光密度值。

1.2.7 TNF-α的检测 采用双抗体夹心ELISA方法检测培养上清中TNF-α含量，严格按照小鼠TNF-α ELISA试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理 以上各组实验至少独立重复3次，结果采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析计量资料以±s表示，以P值＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 直接免疫荧光法鉴定DEN2 直接免疫荧光法检测Ana-1细胞上DEN2 E蛋白。结果显示，在病毒感染组Ana-1细胞中可见FITC标记的DEN2 E蛋白抗体所发出的黄绿色荧光，正常组Ana-1细胞未见黄绿色荧光(图1)。

2.2 RT-PCR扩增曲线 对DEN2 E基因、iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12p40、GAPDH 基因分别进行 RTPCR检测，结果显示本实验各目的基因特异性强(图2)、扩增效率高(图3)。

2.3 DEN2在Ana-1细胞的复制 实时定量RTPCR显示被DEN2感染后Ana-1细胞病毒核酸在72小时达峰值，120小时明显下降。2-ΔΔCt值分别为159.98±37.80、3.69±0.38，差异有统计学意义(P值 ＜0.01)(图4)。

图1 直接免疫荧光法鉴定DEN2吸附Ana-1Fig．1 Identification of DEN2 in Ana-1 by direct immunofluorescence assay

图2 各目的基因RT-PCR熔解曲线图Fig．2 RT-PCR dissolution curve of the purpose genes

图3 各目的基因RT-PCR扩增曲线图Fig．3 RT-PCR amplification curve of the purpose genes

图4 实时定量RT-PCR检测Ana-1细胞中DEN2的表达Fig．4 mRNA expression of DEN2 in Ana-1 cell by Real time RT-PCR

表2 各实验组Ana-1培养上清中 TNF-α浓度 (pg/ml，±s，n=3)Tab．2 The dynamic level of TNF-α in the Ana-1 culture supernatants(pg/ml，±s，n=3)

表2 各实验组Ana-1培养上清中 TNF-α浓度 (pg/ml，±s，n=3)Tab．2 The dynamic level of TNF-α in the Ana-1 culture supernatants(pg/ml，±s，n=3)

Note:Compared with control group，M2 group，1)P ＜0.01.

Time Groups24 h 72 h 120 h Control 33.24±6.62 36.12±5.12 35.12±7.74 M1 256.09±10.111)372.02±12.141)340.29±12.441)M2 46.81±8.21 52.81±8.41 49.06±7.13 DEN2 166.62±11.141)454.72±13.411)221.75±11.181)

图5 实时定量PCR检测Ana-1细胞中iNOS、Arg-1的表达Fig．5 mRNA expression of iNOS，Arg-1 in Ana-1 cell by Real time RT-PCR

图6 Ana-1细胞iNOS、Arg-1蛋白表达Fig．6 Expression of iNOS，Arg-1 protein in Ana-1 cell

图7 实时定量PCR检测Ana-1细胞中IL-12p40、IL-10的表达Fig．7 mRNA expression of IL-12p40，IL-10 in Ana-1 cell by Real time RT-PCR

图8 Ana-1细胞TLR7蛋白表达Fig．8 Expression of TLR7 protein in Ana-1 cell

2.4 iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白表达 对各组细胞的iNOS、Arg-1 mRNA进行实时定量RT-PCR检测，结果显示DEN2感染组、M1型极化对照组iNOS mRNA水平较正常组及M2型极化对照组显著升高(P ＜0.01)，72 小时达峰值，2-ΔΔCt值分别为29.09 ±3.70、18.35±3.52;DEN2感染组 24、72小时的Arg-1 mRNA水平明显低于同期M2型极化对照组(P＜0.01)(图5)。Western blot显示 DEN2感染组、M1型极化对照组iNOS蛋白在24、72、120小时均高于同期正常对照组及M2型极化对照组，72小时达峰值。Arg-1蛋白表达显著低于M2型极化组(图6)。

2.5 细胞因子产生情况 DEN2感染组IL-12p40 mRNA 水平在 72 小时达峰值，2-ΔΔCt值为 11.1 ±2.41，明显高于 M2型对照及正常对照组(P＜0.05);IL-10 mRNA水平与同期正常对照组相比无统计学差异(P＞0.05，图7)。DEN2感染组、M1型极化对照组培养上清中TNF-α浓度均明显高于同时段M2型极化对照及正常对照组(P＜0.01)，且在72小时达到峰值，随后下降(表2)。

2.6 TLR7表达情况 Ana-1细胞被DEN2感染后TLR7蛋白表达下降，低于同期正常对照组，且呈逐渐下降趋势。M1、M2型极化对照组TLR7较正常对照组无明显差异(图8)。

3 讨论

巨噬细胞具有明显的异质性，在不同的环境因素影响下可以极化为不同的亚群，表现出截然不同的生物学功能［9，10］。巨噬细胞是登革感染的靶细胞［11］，本研究用直接免疫荧光及实时定量PCR验证了DEN2能感染小鼠巨噬细胞系Ana-1，并发现病毒载量随感染时间延长呈现先升高后下降趋势，为后续试验提供了合适的感染体系。

巨噬细胞内iNOS和Arg-1的表达及活性受到精密调控，高表达iNOS，低表达Arg-1被认为是M1型极化的指标［12］。本研究证实DEN2感染 Ana-1细胞后iNOS mRNA及蛋白均有不同程度升高，与病毒载量呈正相关。Arg-1 mRNA及蛋白无明显升高，说明DEN2诱导巨噬细胞可向M1型极化。产生不同细胞因子是极化巨噬细胞的重要特征，M1分泌大量IL-12，少量IL-10［13］。我们对细胞因子产生情况进行了检测，发现DEN2感染组72小时IL-12p40 mRNA水平明显上升，而IL-10 mRNA相对表达量无明显升高。从细胞因子水平说明DEN2诱导了巨噬细胞向M1型极化。病毒感染早期抗原提呈细胞可产生IL-12，能促进Th0细胞向Th1细胞分化，抑制Th2细胞的活性，在抗病毒感染中有重要作用。IL-12的增高往往提示机体免疫应答加强，对病变进展有重要影响，并可能是导致DEN感染者不同临床转归的一个重要因素［14］。然而，本实验发现Ana-1细胞诱导的M1型极化对照组IL-12p40 mRNA水平并未如预期般上升，这可能与不同细胞模型诱导细胞因子产生的调节因素不同有关。有文献认为IL-10的分泌可以作为巨噬细胞M2型活化的表型标志。本研究发现IL-4诱导的M2型极化对照组IL-10 mRNA相对表达量并无明显增加，推断IL-10对于Th2类细胞因子诱导的M2模型不具有重要意义，这与李康等研究结果相似［8］。

巨噬细胞产生的TNF-α是重要的促炎性细胞因子［15］。也是诱导炎症反应的重要启动因子。TNF-α水平过高，可启动细胞因子反应的病理生理过程。TNF-α可激活血管内皮细胞及白细胞，促进白细胞的趋化，引起局部炎症反应及自身组织器官的损害。本实验中，病毒感染组TNF-α浓度显著升高且TNF-α的浓度与病毒核酸呈正相关，推断登革病毒感染所引发疾病的严重程度与TNF-α的表达有密切的关系，与 Jens、Betty 等研究结果相似［16，17］。

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫中重要的模式识别受体。其中与病毒识别有关的主要是 TLR3、TLR7、TLR8、TLR9。TLR7 参与了巨噬细胞对 ssRNA 的识别［18］。Peifang 等［19］认为TLR7对DEN ssRNA的识别及其介导的促炎性细胞因子的释放，是浆细胞来源树突状细胞发挥抗病毒作用的关键。本研究发现，Ana-1细胞被DEN2感染后明显下调了TLR7的表达。推测可能是DEN2部分抑制了Ana-1细胞的功能，使TLR7表达下调，且这种下调并不随时间延长、病毒载量的减少而恢复，可能是DEN2免疫逃逸的机制之一。

本研究从精氨酸代谢关键酶水平及IL-12、TNF-α等细胞因子水平证实了DEN2感染Ana-1细胞后诱导其向M1型极化。极化早期由于巨噬细胞分泌的iNOS及促炎性细胞因子较少，且病毒下调了巨噬细胞TLR7的表达，导致细胞对病毒的杀伤能力弱，病毒可以在巨噬细胞内复制增殖。随着病毒载量的增加，诱导巨噬细胞M1型极化程度加深，iNOS及促炎性因子增多，产生较强的抗感染作用，病毒载量下降。

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