PDGF-D抗体对体外破骨前体细胞分化过程影响的相关研究①

刘栓得 黄 晨 许红飞 胡 旭 张 超 初同伟 (第三军医大学新桥医院骨科，重庆400037)

恶性肿瘤常常转移至肝、肺、骨等部位［1］。转移性骨肿瘤多数表现为溶骨性骨破坏，病人常常经历多种并发症，包括病理性骨折、椎体压缩与破坏、顽固性骨痛等，这严重地影响了患者的生活质量和生存期［2］。“种子-土壤”学说提示［3］:转移至骨的肿瘤细胞破坏了成骨细胞(Osteoblasts，OBs)与破骨细胞(Osteoclast，OCs)间的生理平衡，使得宿主自身正常OCs过度分化、成熟，进而过度溶骨，造成严重的骨破坏，在此过程中众多肿瘤相关细胞因子发挥了重要作用［4］。

PDGF-D是PDGF家族中的新成员，它是通过进行EST数据库比对寻找新的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)同源体的过程中发现的［5］。PDGF-D一般通过旁分泌的方式作用于细胞表面其特异性受体PDGF受体β(PDGFR-β)，近而发挥促细胞分裂、分化、调节细胞周期等作用［6］。在前期实验中，我们引入外源性PDGFD，在没有NF-κB配体激活因子(Receptor or Activator of NF-κB Ligand，RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor，M-CSF)联合诱导的条件下成功诱导PBMCs成为OLCs(结果不在此详述)，但PDGF-D抗体是否可以阻断此活化过程尚不知晓，因此本实验引入外源性人重组PDGF-D Ab体外刺激PBMCs，观察其对OCs分化过程的影响。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂 采集16例健康志愿者外周血，白细胞计数均为正常范围内。重组人PDGF-D、重组人 PDGF-D Ab(R＆D systems)、α-MEM 培养基和D-Hanks液(HyClone)、优质胎牛血清(Gibco)、人外周血淋巴细胞分离液及TRIczol(TBD)、TRAP染色试剂盒(Sigma)、骨磨片(自制)、人MMP-9酶联免疫吸附试验试剂盒(上海迪奥生物制品)、Prime-Script®逆转录试剂盒及荧光染料SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)、兔抗人Cathepsin K单克隆抗体(Bioss)、羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗、彩色预染蛋白质分子量标准、青链霉素双抗、SDS蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天)。

1．2 方法

1．2．1 外周血单个核细胞的分离纯化采集健康成人新鲜外周血40 ml［1］，按照人外周血淋巴细胞分离液(TBD)说明书操作，分离出的外周血单个核细胞于α-MEM培养基(含10%FBS，1%青链霉素双抗)吹打均匀，细胞计数后按照密度1×106个/ml单核细胞接种于100 ml细胞培养瓶中，于37℃，5%CO2环境的细胞培养箱中孵育48小时。弃上清，DHanks液反复漂洗，1．5 ml 0．25% 胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集细胞后1 000 r/min，离心8分钟，α-MEM培养基重悬细胞，将获得的PBMCs细胞密度调整为 1 ×107ml－1。

1．2．2 实验分组 本实验分为诱导组IG(α-MEM培养基+10%FBS+1%青链霉素双抗+50 ng/ml PDGF-D)、阻断组BG(α-MEM培养基+10%FBS+1%青链霉素双抗+50 ng/ml PDGF-D+30 ng/ml PDGF-D Ab)及对照组CG(α-MEM培养基+10%FBS+1%青链霉素双抗)，将各组100 μl细胞悬液均匀接种于96孔培养板中，每组3个复孔，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中孵育，每3天换液，连续培养15天。

1．2．3 细胞形态的观察及细胞骨吸收功能鉴定倒置相差显微镜观察各组细胞的形态。于诱导的第15天对各组细胞进行TRAP染色观察，严格按照TRAP染色试剂盒说明进行，PBS液漂洗后苏木精复染细胞核。于倒置相差显微镜下观察每孔随机6个视野中TRAP染色阳性OLCs(胞核≥3个)并摄片。骨磨片吸收陷窝分析:取出预置的骨磨片(自备的牛股骨片)经2．5%戊二醛液固定15分钟，去离子水超声清洗3次，每次10分钟，梯度乙醇脱水，自然晾干，1%甲苯胺蓝染液室温染色20秒，PBS反复冲洗晾干，倒置相差显微镜下观察骨吸收陷凹形态。

1．2．4 Real-time PCR 检测 TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表达 于第15天收集各组细胞(1．0 ×106个)，加入 1 ml TRIczol并依照使用说明提取各组细胞总RNA，取待测样本各2 μl RNA于微量核酸仪测定浓度，选取OD(260)/OD(280)为1．8 ～2．0 的 RNA 样本，依照 PrimeScript®逆转录试剂盒操作说明进行。使用Primer Premier 6．6软件设计相关引物并由上海生工生物技术有限公司合成。GAPDH引物序列:正义链 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反 义 链 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，片段长度258 bp;Cathepsin K引物序列:正义链 5'-AAGAGGTGGTTCAGAAGATG-3'，反义链5'-TATTGGAAGGCATTGGTCAT-3'，片段长度113 bp;TRAP引物序列:正义链 5'-GCAAGGTCCCCAACGGCTATC-3'，反义链 5'-GCCTCGGCAGCCTGGTCT-3'，片段长度112 bp;MMP-9引物序列:正义链5'-CGACCAAGGATACAGTTTGTT-3'，反义链5'-GCGGTACATAGGGTACATGAGC-3'，片段长度107 bp。PCR反应体系为20 μl，反应液各组成分别为:SYBR Premix Ex TaqII 10 μl，上游引物 0．8 μl，下游引物 0．8 μl，DNA 模板 2．0 μl，dH2O 6．0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0．4 μl。每组 3 个复孔。PCR反应条件为，95℃，30秒，1个循环;95℃，5秒，58℃，34秒，40个循环。反应体系于ABI 7500 Realtime PCR仪上进行检测，自动扫描并记录荧光强度。通过调整模板浓度使内参GAPDH扩增Ct值介于18～30之间。应用ABI 7500 System SDS Soft-ware1．3．1软件进行数据处理，其相对表达量采用2－ΔΔCt方法计算。独立重复实验3次。

1．2．5 ELISA法检测MMP-9在各组细胞上清中的表达 收集各组第15天细胞上清液，于3 000 r/min，离心10分钟以去除颗粒和聚合物，设置标准品和细胞上清液样本孔，调整体系为50 μl，所有检测均采用复孔检测，具体操作严格按照MMP-9 ELISA试剂盒(上海迪奥)说明进行，最终反应板于TECAN F039300酶标仪(奥地利)上测定蛋白的浓度(μg/ml)［8］。根据标准品 MMP-9的抗原浓度值设为X轴，其对应的OD(450 nm)吸光值设为Y轴，建立标准曲线的直线回归方程［(Y=0．89X+0．133，R2=0．999 9)］，各样品的浓度可由标准曲线获得。独立重复实验3次。

1．2．6 Western blot检测各组细胞 Cathepsin K 蛋白的表达 SDS裂解液分别裂解第15天各组细胞并提取细胞内总蛋白，BCA蛋白浓度测定法进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳分离后湿转法电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，兔抗人Cathepsin K多克隆抗体(1∶100)4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次10分钟，羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500)，37℃孵育1小时，TBST漂洗3次，每次10分钟，ECL法显色、曝光8分钟并摄影。用Image J分析软件分析图片各条带灰度值。

2 结果

2．1 TRAP染色和骨吸收实验观察破骨样细胞倒置显微镜下观察，培养第15天各组细胞经TRAP染色显微镜下观察(图1)，诱导组可见多个多核破骨样细胞细胞，胞浆呈现紫红色颗粒沉淀反应，颜色均匀，胞核蓝染，胞内可见多核(胞核≥3个)，可见深色核仁，细胞呈典型的“荷包煎蛋”样形态;而阻断组和对照组细胞较小，多为单核，部分细胞胞浆皱缩，核固缩，呈现凋亡状态，未见多核破骨样细胞。骨片经甲苯胺蓝染色后观察(图2)，诱导组细胞骨片上可观察到骨面虫蚀状骨吸收陷凹，陷凹面积较大且呈现破骨样细胞样形态，陷窝边缘呈不规则放射状，颜色相对背景较深;而阻断组和对照组骨片上未见骨吸收陷凹形成。结果提示:诱导组可培养可得到成熟破骨样细胞并具有骨吸收能力，而在同样条件下引入PDGF-D Ab后，阻断组OLCs分化受到明显抑制。

图1 第15天，诱导组可见TRAP阳性OLCs，而阻断组和对照组未见(×200)Fig．1 The OLCs were detected and showed in TRAP staining test in IG，but there was no one detected in CG and BG(×200)

图2 第15天，诱导组可见骨吸收陷窝，而阻断组和对照组未见(×200)Fig．2 The OLCs were detected and showed in bone resorption test in IG，but there was no one detected in CG and BG(×200)

图3 三组细胞中TRAP、MMP-9、Cathepsin K mRNA的相对表达Fig．3 At the 15 d，therelative mRNA expression levels of TRAP，MMP-9 and Cathepsin K in 3 groups were detected by Real-time PCR

图4 第15天，各组细胞上清液中MMP-9的相对表达Fig．4 At the 15 d，the expressions of MMP-9 protein in 3 groups were detected by ELISA

2．2 Real-time PCR 检测 TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表达 三组细胞培养15天后，Real-time荧光定量PCR检测TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表达:第15天阻断组和对照组TRAP、Cathepsin K、MMP-9 mRNA的表达均显著低于诱导组(P＜0.05)，其中以TRAP mRNA相对表达的差异最为显著;阻断组和对照组的表达无明显差别(P＞0．05)。

2．3 ELISA法检测MMP-9在各组细胞上清中的表达 检测第15天各组细胞上清中MMP-9蛋白的表达情况:诱导组［(289．96 ±7．35)μg/L］，显著高于阻断 组 ［(187．28 ± 5．64)μg/L］和 对 照 组［(194．34 ±6．53)μg/L］，P 值均 ＜0．05，而阻断组与对照组间差异无统计学意义(P＞0．05)。结果显示PDGF-D Ab可抑制PNMCs向OLCs分化过程中MMP-9的表达(图4)。

图5 第15天各组细胞Cathepsin K蛋白的表达及灰度分析Fig．5 At the 15 d，the expressions of the Cathepsin K protein were detected in 3 groups by Western blot and there was a relative density of them

2．4 Western blot检测各组细胞Cathepsin K蛋白的表达 提取各组第15天细胞的总蛋白，Western blot检测各组细胞中Cathepsin K蛋白的表达，内参为GAPDH，曝光显像后射片，Image J分析软件分析图片各条带灰度值:阻断组和对照组Cathepsin K蛋白的表达量无显著差异(P＞0．05)，而两组均显著低于诱导组Cathepsin K的表达(P值均＜0．05，图5)。

3 讨论

肿瘤骨转移造成的骨破坏是一个十分复杂的过程，其中包括肿瘤细胞的脱落、迁移、侵袭、粘附和定植等多个过程［9］。而OCs作为体内专职骨吸收细胞，其过度活化成为造成骨破坏的关键事件。RANKL和M-CSF联合诱导外周血单个核细胞向OLCs分化的方法是较为经典的获得OLCs方法，但Huang等［10］通过用 PDGF-D体外刺激鼠单核细胞系RAW264．7，成功将其诱导分化为 OLCs，而后于该实验组内加入OPG，经诱导后同样分化为OLCs，因此认为该途径独立于RANKL/RANK/OPG信号通路之外。本课题组于前期实验中证明，PDGF-D可独立诱导PBMCs分化为OLCs，并且其形态、功能以及OCs的标志性基因和蛋白的表达与经典诱导方法获得的OLCs无差异。

PDGF-D由370个氨基酸组成，分子量约为40.2 kD，也是PDGF家族新成员之一，起着促进细胞增殖、侵袭和促血管生成等作用［11］。以酶原形式分泌的PDGF-D蛋白无活性，在纤溶蛋白酶等多种蛋白酶的水解作用下，将其铰链区N末端CUB结构和C末端生长因子结构分离开来，形成同源二聚体PDGF-DD后作用于其特异性受体 PDGFR-β，从而发挥其生物学功能［12］。Wang 等［13］通过 siRNA 使得胰腺癌PDGF-D的表达下调，从而使Notch-1和NF-κB信号通路失活进而抑制了细胞生长和血管生成，降低了肿瘤细胞的侵袭能力。同时，Kong等［14］证实PDGF-D过表达可提高前列腺癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchynal transition，EMT)的能力，从而提高其侵袭转移的能力。

本实验旨在观察PDGF-D抗体对外源性PDGFD的阻断作用，检测其对破骨细胞前体细胞向OLCs分化过程的影响。通过研究发现:诱导组细胞在经过15天的诱导后成为TRAP阳性细胞，并具有骨吸收功能，而阻断组和对照组未见OLCs细胞;同时，OLCs特异性标记物TRAP、Cathepsin K和MMP-9的表达，诱导组均显著高于阻断组和对照组。因此我们认为，PDGF-D抗体可有效阻断PDGF-D诱导单核细胞向OLCs分化的过程，抑制OLCs的生成。

有文献表明，PDGF-D可通过与PDGFR-β作用影响多条下游通路，如 PI3K/Akt、MAPK、Noth等［15-17］，而这些通路与 OCs、OBs的分化、成熟密切相关，但究竟何者为关键尚不知晓。Najy等［18］称过表达PDGF-D的前列腺癌细胞可促进溶骨性反应，那么是否可以通过使肿瘤细胞不表达PDGF-D蛋白，从而抑制破骨细胞的过度分化，或者通过阻断如PI3K/Akt、MAPK、Noth等下游某条或多条通路是否可以抑制溶骨性破坏过程等等，这些均成为我们今后思考和研究的重要方向。

综上所述，我们证实PDGF-D抗体可有效阻断PDGF-D破骨前体细胞向OLCs分化过程，但其在体内作用如何以及PDGF-D对下游通路的影响机制等等需要我们进一步的研究。

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