胃癌组织VEGF表达及血清VEGF浓度与DCs浸润及其活性的关联分析①

肖炜明 吴克艳 龚卫娟 丁岩冰 王 艳 卜 平

(扬州大学第二临床医学院消化内科，扬州225001)

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)被认为是一种重要的促肿瘤生长因子。其不仅通过旁分泌途径刺激肿瘤血管内皮细胞增生、迁移，诱导血管形成而促进肿瘤生长;还具有增强血管通透性，促进单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成，促进肿瘤转移的活性［1，2］。另外，VEGF 还具有免疫调节功能，可通过降低体内免疫监视功能而促进免疫逃逸［3，4］。树突状细胞(Dendritic cells，DCs)作为体内功能最强的抗原递呈细胞，具有很强的摄取、加工、递呈抗原的能力，从而激发抗原特异性的T细胞免疫反应，既往研究也已经证实DCs的浸润及其功能与胃癌的预后、TNM 分期等密切相关［5，6］。因此，本文试图观察胃癌组织VEGF表达强度、血清VEGF浓度分别与胃癌组织内DCs浸润密度的关系，胃癌组织内VEGF阳性DCs浸润频率与胃癌发生与发展的关联;胃癌患者与健康个体外周血单核来源DCs表面HLA-DR和CD86的表达，从而深入揭示VEGF调节DCs活性参与胃癌发病及转移的分子机制。

1 材料与方法

1．1 临床资料 收集2009年4月至2012年7月经我院外科手术，病理证实为胃癌的组织标本142例，其中男性101例，女性41例，平均年龄(61．94±10．23)岁。所有入选病例均无长期使用非甾体消炎药和糖皮质激素类药，术前均未接受过放疗或化疗。肿瘤组织学类型按WHO分级，高中分化腺癌76例，低/未分化腺癌66例;肿瘤大小:＜5 cm者81例，≥5 cm者61例;发生局部淋巴结转移者97例，无局部淋巴转移者45例;未侵及浆膜层者60例，侵及浆膜层者82例;根据2010年国际抗癌联盟(UICC)颁布的第7版胃癌TNM分期系统进行临床分期:Ⅰ期/Ⅱ期74例，Ⅲ期/Ⅳ 期68例。随机选取37例癌旁组织作为对照组，并经过病理检查排除累及肿瘤。随机取20例患者血清，其中男性13例，女性7例，平均年龄(57．90±12．43)岁;健康个体20例，其中男性 12例，女性 8例，平均年龄(56．91±9．68)岁。随机取5例胃癌患者和5例健康个体外周血单个核细胞(PBMC)，经体外诱导为DCs。

1．2 实验材料 鼠抗人VEGF单克隆抗体(mAb)购自Santa Cruz公司;Alex488标记的驴抗鼠、羊抗兔抗体购自Invitrogen公司;兔抗人CD11c抗体购自武汉博士德公司;APC-CD11c mAb、FITC-HLA-DR mAb、PE-CD86 mAb来自 Biolegend公司;人 VEGF ELISA检测试剂盒购自深圳达科为公司;DAPI封片剂购自 VECTASHIELD公司;重组人 GM-CSF、IL-4购自PeproTech公司;重组人VEGF蛋白(rhVEGF)购自R＆D公司;外周血淋巴细胞分离液(Ficoll)购自挪威Axis-shield公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫荧光法检测肿瘤组织 VEGF表达及DCs密度 肿瘤组织经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片，厚4 μm。石蜡切片脱蜡后，梯度酒精水化，95～99℃水浴抗原修复，自然冷却至室温，2%驴或山羊血清室温封闭30分钟。然后孵育鼠抗人VEGF(1∶50 稀释)及兔抗人 CD11c(1∶50 稀释)抗体4℃过夜。PBS洗涤后，同时孵育驴抗鼠、羊抗兔荧光二抗(1∶1 000稀释)37℃避光孵育30分钟，PBS洗涤，自然晾干后，滴加DAPI封片，荧光显微镜观察。

1．3．2 CD11c阳性细胞判断标准 细胞形态完整且不规则，胞浆有明显突起，分布在肿瘤细胞间和(或)肿瘤间质内。红色荧光特异地定位于胞膜内的细胞为阳性细胞。染色结果按参考文献［7］判断:阴性(－)没有或仅有少许染色细胞;阳性(+)散在的染色细胞;阳性(++)癌巢多个染色细胞;阳性(+++)弥散的染色细胞。

1．3．3 VEGF阳性细胞判断标准 细胞形态完整，胞浆着绿色荧光，染色结果判断分别按阳性染色细胞百分数及染色强度计分［8］。阳性细胞数为0，计0分;1%～10%计1分;11% ～50%计2分;51%～75%计3分;＞75%计4分。染色阴性计0分;淡绿色计1分;绿色计2分;深绿色计3分。两种积分相加，积分为0～2分，表示阴性(－);积分≥3分为阳性。其中积分为3分，表示阳性(+);积分为4～5分，表示阳性(++);积分为6～7分，表示阳性(+++)。

1．3．4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清VEGF浓度 按试剂盒提供的操作说明进行，主要步骤:加血清至各检测孔，室温孵育2小时;洗板3次，加检测抗体;混匀后盖上封板膜，室温孵育2小时;洗板3次，加酶标记底物。盖上封板膜，室温孵育20分钟;洗板3次;加入TMB显色，室温避光温育20分钟终止反应;10分钟内在波长450 nm读值。根据标准品绘制标准曲线，计算各检测孔内VEGF浓度。

1．3．5 外周血单核细胞诱导为DCs 利用Ficoll分离外周血单个核细胞，调整细胞密度为2×106ml－1。将细胞铺于 24 孔板中培养，每孔 500 μl，约1×106个细胞/孔，并加细胞因子 GM-CSF(100 ng/ml)、IL-4(40 ng/ml)，37℃，5%CO2孵箱培养。隔日半量换液，培养5天诱导成DCs。

1．3．6 DCs表面 HLA-DR和 CD86表达的检测

取外周血单核细胞诱导而来的细胞悬液，经PBS洗涤后加入 APC-CD11c mAb、FITC-HLA-DR mAb、PECD86 mAb 4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤后400 μl重悬。利用FACS Calibur流式细胞仪，Cellquest软件计数104个细胞，选取CD11c阳性细胞，进而分析HLA-DR及CD86的表达。

1．3．7 重组VEGF(rhVEGF)对DCs表达HLA-DR、CD86的影响 将正常个体和胃癌患者PBMC诱导为未成熟DC后，实验分组加rhVEGF 100 ng/ml，对照组不加药物，两组分别刺激未成熟DC 24小时后，FCM检测DC表达CD86的情况。

1．4 统计学分析 胃癌与癌旁组织VEGF表达、DCs浸润密度的比较采取χ2检验分析;VEGF表达强度与DCs浸润密度的关联采取Spearman等级相关分析;VEGF、DCs双阳性细胞与TNM及淋巴结转移的关联性分析采用秩和检验;胃癌患者血清VEGF浓度与健康个体的比较、HLA-DR及CD86阳性DCs频率的比较均采取t检验。P＜0．05有统计学意义。

2 结果

2．1 胃癌组织VEGF表达与DC浸润密度的关联分析 首先对胃癌组织和癌旁组织分别用VEGF和CD11c的抗体进行免疫荧光染色，发现胃癌组织VEGF阳性表达率 56．33%(图 1)、而癌旁组织VEGF阳性表达率仅为18．91%。另外，胃癌组织内CD11c+细胞的表达阳性率为60．56%(图1)、而癌旁组织的阳性表达率为62．16%。结果显示胃癌组织中VEGF阳性表达率明显高于癌旁组织(χ2=16.452，P ＜0．001);而 CD11c+细胞表达率略低于癌旁组织(χ2=0．032，P=0．859)，但统计学无意义。为进一步明确肿瘤组织VEGF表达是否与DCs浸润密度有相关性，对胃癌组织VEGF表达情况和DCs浸润情况分别判定为“－、+、++、+++”4个等级，利用Spearman等级相关分析，发现VEGF表达强度与 DCs浸润程度呈反向关联(表1，rS=－0.426，P ＜0．001)，提示胃癌细胞可通过分泌VEGF抑制肿瘤组织内DCs的浸润。

图1 免疫荧光法检测胃癌组织内VEGF和CD11c阳性的细胞(×200)Fig．1 VEGF and CD11c staining in gastric cancer tissues detected by immunofluorescence technique(×200)

表1 胃癌细胞VEGF表达水平与DC密度相关性分析Tab．1 Correlation study of VEGF expression level in cancer cells and density of tumor-infiltrating DCs

2．2 胃癌组织VEGF阳性DCs浸润的频率与胃癌分期及淋巴结转移的关联分析 国内外研究发现，肿瘤组织内DCs可分泌VEGF、内皮素-1等参与肿瘤血管生成，特别是肿瘤局部微环境PGE2和钙三醇的刺激可诱导DCs分泌大量的VEGF，进而介导肿瘤血管生成和免疫逃逸［9］。因此本研究分析了胃癌组织和癌旁组织内CD11c+VEGF+双阳性细胞的密度(图 2)，结果发现，胃癌组织中 CD11c+VEGF+双阳性细胞频率为43．66%，癌旁组织双阳性细胞率为10．81%，胃癌组织中双阳性细胞表达率明显高于癌旁组织(表 2，χ2=14.112，P=0.001)。另外，我们分析了CD11c+VEGF+细胞密度与TNM分期、淋巴结转移的关联性(表3:Z=－2.367，P=0．018;表 4:Z= － 2．574，P=0.010)，结果显示CD11c+VEGF+细胞密度与疾病的进展、局部淋巴结转移均正相关。

图2 双色荧光标记检测胃癌组织内VEGF和CD11c双阳性细胞(×200)Fig．2 Immunofluorescent staining of VEGF and CD11c double positive cells in gastric cancer tissues(×200)

2．3 血清VEGF浓度及肿瘤组织内DC浸润密度的关联分析 为分析胃癌患者血清VEGF浓度和肿瘤组织内DC浸润密度是否关联，我们首先比较20例胃癌患者和20例健康个体血清内VEGF水平。结果发现，胃癌患者血清内 VEGF浓度均值为(354.98 ±231．11)pg/ml，而健康个体 VEGF 浓度均值为(66．11 ±62．86)pg/ml，胃癌患者血清内 VEGF浓度显著增高(图3，t=5．394，P ＜0．001)。进一步分析胃癌患者血清VEGF浓度与肿瘤组织内DCs密度的关联，发现二者没有明显的关联性(rS=0.114，P=0．63)。提示血清VEGF浓度对肿瘤组织内DCs迁移没有影响。

2．4 胃癌外周血单核细胞来源DCs表面HLA-DR及CD86表达的检测 为观察胃癌患者体内DCs细胞的活性状态，分离5例胃癌和5例健康个体外周血单核细胞，经GM-CSF和IL-4诱导为DCs，分别检测CD11c细胞表面MHCⅡ类分子(HLA-DR)和共刺激分子CD86的表达。HLA-DR在健康个体及胃癌患者表达率分别为(99．86 ±0．06)%、(84．44 ±8．73)%(t=4．241，P=0．003);CD86 在健康个体及胃癌患者表达率分别为(62.48±10.46)%、(40.82 ±5．42)%(t=4．111，P=0．003)(图 4 ～6)。结果显示，与健康个体相比，胃癌患者外周血单个核细胞来源DCs表面HLA-DR和CD86的表达均降低。为分析DCs表面CD86表达的降低是否与胃癌血清高水平VEGF有关，我们将rhVEGF作用胃癌患者来源的DCs细胞，测得rhVEGF组的CD86表达为(37．94±6．36)%，对照组为(56.70±7.80)%，(t=5．104，P=0．001);而 rhVEGF 作用健康个体来源的 DCs细胞，rhVEGF组的 CD86为(54．30 ±3．81)%，对照组为(57．08 ±6．43)%，(t=0.832，P=0．430)(图 7)。结果证实重组VEGF可直接下调胃癌患者 DCs表面 CD86的表达。

表2 胃癌与癌旁组织内CD11c+VEGF+细胞密度比较Tab．2 Comparative analysis of density of CD11c+VEGF+cells in gastric cancer tissues and adjacent tissues

表3 肿瘤组织内CD11c+VEGF+细胞密度与TNM分期关联性分析Tab．3 Correlation study of density of CD11c+VEGF+cells in tumor tissues with TNM stages

表4 肿瘤组织内CD11c+VEGF+细胞密度与淋巴结转移关联性分析Tab．4 Association correlation study of densitiesof CD11c+VEGF+cells in tumor tissues with lymph node metastasis

图3 胃癌患者血清VEGF浓度较正常个体显著增高Fig．3 Serum level of VEGF is higher in gastric cancer patients than healthy controls

图4 外周血单核细胞诱导而来DCs表面HLA-DR和CD86的检测Fig．4 Detection of HLA-DR and CD86 expression on peripheral blood monocyte-derived DCs by flow cytometry

图5 胃癌患者外周血单核细胞来源DCs表面HLA-DR的表达降低Fig．5 Decreased expression of HLA-DR on peripheral monocyte-derived DCs in gastric cancer

图6 胃癌患者外周血单核细胞来源DCs表面CD86的表达降低Fig．6 Decreased expression of CD86 on peripheral monocyte-derived DCs in gastric cancer

图7 重组VEGF下调胃癌患者外周血单核细胞来源DCs表面表达HLA-CD86Fig．7 Recombinant VEGF down-regulated CD86 expression on DCs in gastric cancer

3 讨论

本研究基于胃癌临床标本，首先利用免疫荧光和ELISA方法分别分析了肿瘤组织内胃癌细胞VEGF表达、血清VEGF浓度与肿瘤组织内DCs浸润密度的关联，发现胃癌细胞原位表达VEGF与DCs浸润存在明显的负相关，而血清VEGF浓度对肿瘤DCs浸润无明显影响，提示肿瘤微环境内高浓度VEGF表达可通过抑制DCs的迁移或分化，从而介导免疫逃逸。另外，本研究比较了胃癌组织与癌旁组织分泌VEGF的DCs频率，发现癌组织内DCs分泌VEGF的频率显著高于癌旁组织，提示肿瘤组织内浸润的DCs可能通过分泌VEGF来促进肿瘤血管生成而参与疾病进展。最后，本研究证实外周血单核细胞来源DCs表面HLA-DR和CD86的表达均降低，且重组VEGF可直接抑制DCs表达CD86，说明胃癌患者体内DCs处于低活性或负向免疫调节状态。因此，本研究为VEGF参与胃癌进展及免疫逃逸提供了直接依据。

肿瘤细胞在低氧状态时分泌大量VEGF，促进肿瘤局部新生血管的生成，且同时抑制局部DCs的功能。国外研究证实VEGF在体外和体内抑制DCs细胞的分化、以及抑制LPS诱导的DCs成熟，抑制DCs分泌 IL-12［10，11］。给小鼠注射重组 VEGF 蛋白可拮抗FILT3对DCs的刺激作用［12］。在肿瘤细胞和DCs共培养体系中，加入 VEGF抗体，可促进CD34+细胞向DCs的分化［13］。本研究证实胃癌细胞分泌VEGF与DCs浸润呈负相关，但胃癌细胞来源的VEGF是直接抑制DCs的浸润还是抑制DCs源自造血干细胞的分化发育过程，尚需深入研究。

血清高水平VEGF促进肿瘤患者的进展，与外周血循环DCs的密度呈负相关［14］。本研究则显示血清VEGF水平与肿瘤浸润DCs无关，这提示肿瘤组织内DCs活性主要受局部肿瘤细胞来源VEGF的影响。另外，胃癌患者外周血单核细胞来源的DCs表面HLA-DR和CD86均降低，而重组VEGF直接抑制DCs表达CD86，但VEGF是否直接影响DCs对CD4+T/CD8+T细胞的活化，或发挥调节性DCs的活性，促进调节性T细胞(Treg)的产生、增殖及活性，需要深入分析。

肿瘤组织内肿瘤细胞和局部浸润的DCs之间存在相互作用(Crosstalk)，特别在肿瘤晚期，肿瘤细胞来源的IL-10、TGF-β、PGE2往往诱导局部DCs具有免疫调节和耐受活性，而不是免疫激活功能，主要表现为低表达 TLR4、MHC Ⅱ类分子、CD40、CD80、CD86 和 IL-12，而分泌较多 IL-10［15］。我们在胃癌组织内发现了较高频率VEGF阳性的DCs细胞，且其与临床分期及淋巴结转移均呈正相关性，提示该群DCs具有免疫调节活性，但这群DCs在胃癌组织内如何被诱导产生以及其他表型特点需要深入研究，进而对筛选有效抑制该群DCs活性或诱导DCs向免疫激活方向分化的药物具有重要意义。

综上所述，胃癌细胞VEGF的表达强度与肿瘤组织DCs浸润密度负相关，而胃癌患者血清高浓度VEGF与其外周血单核细胞来源的DCs表面HLADR和CD86表达降低有关，肿瘤组织内分泌VEGF的DCs频率与胃癌进展呈正相关，提示采取靶向抑制肿瘤细胞分泌VEGF和增强DCs功能的治疗方法，将有望取得较好的抗肿瘤治疗效果。

1 Tie J，Desai J．Antiangiogenic therapies targeting the vascular endothelia growth factor signaling system［J］．Crit Rev Oncog，2012;17(1):51-67．

2 Eichmann A，Simons M．VEGF signaling inside vascular endothelial cells and beyond［J］．Curr Opin Cell Biol，2012;24(2):188-193．

3 Kim H，Kataru R P，Koh G Y．Regulation and implications of inflammatory lymphangiogenesis［J］．Trends Immunol，2012;33(7):350-356．

4 Sheng K C，Wright M D，Apostolopoulos V．Inflammatory mediators hold the key to dendritic cell suppression and tumor progression［J］．Curr Med Chem，2011;18(36):5507-5518．

5 黄海力，吴本俨，龙伟缔et al．树突状细胞浸润对进展期胃癌生物学行为和预后的影响［J］．中华肿瘤学杂志，2003;25(5):468-471．

6 Nat sugoe S，Tokuda K，Nakajo A et al．Clinical impact of intratumoralnatural killer cell and dendritic cell infiltration in gastric cancer［J］．Cancer Lett，2000;159(1):103-108．

7 Ohashi S，Okamura S，Urano F et al．Clinicopathological variables associated with lymph node metastasis in submucosal invasive gastric cancer［J］．Gastric Cancer，2007;10(4):241-250．

8 Blanchot-Jossic F，Jarry A，Masson D et al．Up-regulated expression of ADAM17 in human colon carcinoma:co-expression with EGFR in neoplastic and endothelial cells［J］．J Pathol，2005;207(2):156-163．

9 Sozzani S，Rusnati M，Riboldi E et al．Dendritic cell-endothelial cell cross-talk in angiogenesis ［J］．Trends Immunol，2007;28(9):385-392．

10 Bennaceur K，Chapman J，Brikci-Nigassa L et al．Dendritic cells dysfunction in tumour environment［J］．Cancer Lett，2008;272(2):186-196．

11 Lissoni P，Malugani F，Bonfanti A et al．Abnormally enhanced blood concentrations of vascular endothelial growth factor(VEGF)in metastatic cancer patients and their relation to circulating dendritic cells，IL-12 and endothelin-1［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2001;15(2):140-144．

12 Ohm J E，Shurin M R，Esche C et al．Effect of vascular endothelial growth factor and FLT3 ligand on dendritic cell generation in vivo［J］．J Immunol，1999;163(6):3260-3268．

13 Michielsen A J，Hogan A E，Marry J et al．Tumour tissue microenvironment can inhibit dendritic cell maturation in colorectal cancer［J］．PLoS One，2011;6(11):e27944．

14 Huang A，Gilmour J W，Imami N et al．Increased serum transforming growth factor-beta1 in human colorectal cancer correlates with reduced circulating dendritic cells and increased colonic Langerhans cell infiltration ［J］．Clin Exp Immunol，2003;134(2):270-278．

15 Ma Y，Shurin G V，Gutkin D W et al．Tumor associated regulatory dendritic cells［J］．Semin Cancer Biol，2012;22(4):298-306．