C5a受体拮抗剂对小鼠缺血再灌注损伤的保护作用

郑力通 马铭泽 晏沐阳 (解放军总医院心血管病研究所，北京 00853)

大脑短暂缺血后，恢复血供时会发出一个强烈的炎症应答，引起脑组织继缺血后的第2次损伤，即脑缺血/再灌注(I/R)损伤。补体级联反应是这种炎症事件的一个重要递质。在不同的器官系统(包括心肌、肠道、四肢)的I/R损伤都涉及补体激活，也被公认作为一个可能的I/R损伤治疗靶点〔1～4〕。有针对性的观察补体级联反应的各个组成部分，探究脑I/R损伤的发病机制，可确定它们各自的作用和价值〔5〕。补体分子C5通过经典或替代途径裂解成C5a和C5b，C5b同C6～C9形成膜攻击复合物，这可能会导致细胞和细菌的裂解〔6〕。C5a是一种过敏毒素，是一种强效的炎症细胞聚集和激活的始作俑者，因此表现出调节炎症的特点。本文旨在探讨C5a受体拮抗剂对小鼠I/R损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验用鼠 健康雄性C57Bl/6小鼠，鼠龄8～10 w、体重22～26 g，由军事医学科学院动物中心提供。随机分为空白对照组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、C5a受体拮抗剂(C5aRA)组，每组8只。在缺血发作前45 min，对每个雄性C57Bl/6老鼠按照1 mg/kg的量腹腔注射C5aRA或同等体积的PBS液体。

1.2 小鼠脑I/R模型的制作〔7〕小鼠1%戊巴比妥钠，腹腔麻醉后，仰卧位固定，颈部中线切口。分离小鼠右侧颌下腺提反向外侧，分离并暴露右侧的颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，并在近心端结扎颈总动脉，在远心端结扎颈外动脉，离断颈外动脉远端。沿颈内动脉向深部继续分离暴露翼腭动脉后，血管夹同时夹闭翼腭动脉。在颈外动脉远心端用显微剪刀剪一小口，插入制备好的线段(8个0的单丝线，长约11 mm，前段均匀包被一层硅胶使尖端圆钝)，转过颈总动脉分叉，进入颈内动脉。插入线段直至遇到阻力，插入长度以过颈总动脉分叉约0.8 cm为宜，即线段外露1 mm左右。插线结束后，将预先放置于颈外动脉的结扎线缚紧，以防止线段滑出和出血。颈部伤口常规缝合。60 min后，再次麻醉小鼠，分离暴露右侧颈外动脉，松开固定线，拔除线段即可实现再灌注。

1.3 神经功能缺失评分 Longa 5分法评分标准:0分表示无异常;1分提尾时左前肢内收，表示轻度运动低下;2分为向左侧倾斜;3分向左侧旋转;4.0分不能自行行走或昏迷。1～4分为有效模型。

1.4 脑梗死灶大小的计算 术后24 h断头取脑，置于小鼠脑冠状切片磨具中，切成2 mm厚片。将切片置于2%红四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液中，避光染色30 min后，置于10%多聚甲醛中固定。白色为梗死灶，红色为正常脑组织。应用图像分析系统测量脑梗死面积。根据公式V=t×(A1+A2+…+An)算出梗死体积。其中t为切片厚度，A为每个切片尾侧梗死面积，n为单个鼠脑的切片数。t=2 mm，n=4。

1.5 组织病理学观察 术后24 h，1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉后，开胸暴露心脏，用PBS心脏冲洗后，4%多聚甲醛(pH7.2～7.4)灌注，断头取脑，置于相同灌注液12 h后依次脱水、透明、浸蜡及包埋，行5 μm厚冠状切片，进行HE染色。

同样，C5与其他器官系统的再灌注损伤也有关联。C5aRA是一种环肽。目前研究最广泛的是AcF〔OpdChaWR〕(PMX-53)。已被证明在不同的啮齿动物疾病模型中可明显阻碍C5a的介导效果〔11〕。局部缺血前应用C5aRA能充分抑制I/R诱导的肾损害〔12〕。此外，抗C5抗体和C5aRA都已被证明减弱局部缺血鼠小肠的再灌注损伤〔13，14〕。这些发现表明，与遗传缺陷对比，在缺血前期改变C5或C5a的活性对急性炎症更有针对性，从而限制再灌注损伤。

但C5a受体介导确切的调节机制仍然未知。未来的研究必须阐明作用机制，即通过上调脑中C5aR后脑I/R损伤和靶向，来调解其效能。此外，继续努力追踪验证缺血后疗效。定义C5a受体抑制对I/R损伤的治疗窗将至关重要，在评估其治疗I/R损伤相关目标的临床潜能。此外，鉴于在心肌缺血患者亚组的抗C5疗法最近的临床疗效和安全性特点〔15〕，应观察脑缺血中C5a的作用以及其在I/R损伤治疗中的深远潜力和有利进展。

2 结果

2.1 梗死体积 与PBS组(35.0% ±2.1%)比较，C5aRA组梗死体积(26.2% ±2.5%)显著减少(P=0.02)。见图 1。C5aRA组梗死体积比PBS组减少了26%。

图1 两组梗死体积

2.2 神经功能缺损 C5aRA组(2.3±0.15)比PBS组(2.4±0.11)在神经功能缺损评分上有改善的趋势(P=0.09)。

3 讨论

脑血管疾病发病机制及安全有效的治疗措施目前还不清

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