MMP－1及MMP－3在心肌肥厚大鼠中的表达及奥美沙坦对其影响

李 涵 赵玉兰 张 强 (郑州大学第二附属医院心血管内科，河南 郑州 450014)

心肌肥厚是多种心血管疾病的共同病理过程，其发生的结构基础主要是心肌细胞增大和纤维化。其过程包括了心肌细胞肥大和间质成分改变，亦可称为心肌重构。心肌重构最终导致冠脉血流储备减少，增加心肌缺血，从而导致心衰、心律失常、猝死等。目前多项研究表明，细胞外基质(ECM)尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的异常改变，在心肌重构中起重要作用。细胞外基质(ECM)的改建，尤其是心肌胶原的沉积与心肌细胞肥大不同步发展是促使心肌肥厚由代偿向失代偿转变的主要原因之一〔1〕。多项研究已经证明心肌重构的产生与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)有关。奥美沙坦作为ARB类药物可完全阻断血管紧张素Ⅱ与其受体的结合，从而抑制心肌重构。本实验建立心肌肥厚大鼠模型，观察大鼠心肌中MMP-1、MMP-3的表达水平，并用奥美沙坦进行干预，为奥美沙坦改善心肌重构提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由郑州大学实验动物中心提供雄性Wistar大鼠300～350 g 30只，随机分为对照组(甲组)、模型组(乙组)、干预组(丙组)，每组10只，三组间重量无统计学意义。

1.2 心肌肥厚模型制备 (1)三组均于大鼠背部皮下注射，甲组按3 ml·kg－1·d-1注射生理盐水，每天 2次，连续 10 d。乙组、丙组按3 mg·kg－1·d－1注射异丙肾上腺素，每天2次，连续 10 d，同时甲、乙组生理盐水灌胃 1 ml/d，丙组按10 mg·kg－1·d－1奥美沙坦灌胃一次，连续 10 d。(2)三组大鼠10 d用药后称其重量，再将各组用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，开胸取心脏，称取全心湿重及左心室湿重。左心室一部分心肌标本保存在液氮中，用于提取RNA进行实时PCR，另一部分置于100 g/L多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋切片(5 μm)。

1.3 HE染色 将取出的心脏标本置4%多聚甲醛固定24 h(4℃)，常规石蜡包埋，沿左室长线每隔1 mm横断面切取数张5 μm 厚，HE 染色。

1.4 心肌肥厚组织MMP-1、MMP-3 mRNA的测定 实时荧光定量PCR测定肥厚心肌MMP-1 mRNA的相对表达。①总RNA的提取。将在液氮中冻存的样品取出后剪碎，使用TRIzol试剂盒提取总RNA(步骤详见说明书)。②cDNA的合成。1 μl总RNA通过随机引物M-MLV以15 μl体系逆转录生成所需cDNA。③实时 PCR。MMP-1 的参数为94℃3 min，94℃ 30 s，72℃1 min，72℃5 min，40个循环。依据扩增长度配制1.5%琼脂糖凝胶(50 ml)，微波炉加热前加入核酸凝胶染色剂GelRed 5 μl(即稀释至1∶10 000)，冷却后制胶，取 5 μl PCR 产物加1.0 μl上样缓冲液(0.25%溴芬蓝，40%蔗糖)，稳压电泳80 V约40 min。凝胶在UVP凝胶成像系统中扫描观察结果、拍照，采用图像分析软件BandScan5.0分析电泳条带的光密度值，计算MMP-1内参的光密度积分值比值作为MMP-1的相对表达量。MMP-3测定参照MMP-1。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0软件处理数据，计算资料以表示，组间资料采用单因素方差分析及LSD检验。

2 结果

2.1 三组大鼠体重，心脏重量，左室重量，左室重量指数比较

见表1。三组实验大鼠体重差异均无统计学意义(P＞0.05)，乙组、丙组的左室重量、心脏重量、左室重量指数都高于甲组(P＜0.05)，丙组左室重量、心脏重量、左室重量指数均低于乙组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠左室重量、心脏重量、左室重量指数和体重的比较(，n=10)

表1 各组大鼠左室重量、心脏重量、左室重量指数和体重的比较(，n=10)

与甲组比较:1)P＜0.05;与乙组比较:2)P＜0.05;下表同

组别 左室重量(mg)心脏重量(mg)左室重量指数(mg/g)10 d后体重(g)甲组 614.44±4.92 753.89±9.31 1.78±0.01 344.97±5 344.48±1.63.46乙组 867.25±3.911) 970.05±5.541) 2.47±0.021) 350.83±2.91丙组760.83±4.251)2)874.56±6.611)2)2.20±0.011)2)

2.2 三组大鼠心肌组织病理改变 对照组小鼠心肌细胞排列整齐，模型组和干预组与对照组相比心肌细胞均有肥大现象，心肌间隙增宽，且模型组较干预组更为明显。

对照组心肌细胞结构正常，排列整齐;模型组细胞明显肥大且排列不规则，心肌组织中纤维结缔组织增生;干预组大鼠的心肌细胞亦有病理损伤，但损伤程度较模型组轻。见图1。

2.3 三组大鼠心肌MMP-1、MMP-3 mRNA表达的比较 见表2，图2。乙组、丙组MMP-1、MMP-3 mRNA表达高于甲组(P＜0.05)，乙组高于丙组(P＜0.05)。

表2 各组大鼠心肌细胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表达(，n=10)

表2 各组大鼠心肌细胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表达(，n=10)

组别MMP-1 MMP-3甲组0.107±0.009 0.084±0.007乙组 0.626±0.037 0.405±0.024丙组0.313±0.018 0.196±0.013

图1 三组大鼠心肌组织病理改变(HE，×100)

图2 三组大鼠MMP-1、MMP-3 mRNA表达

3 讨论

心肌肥厚是心脏对慢性压力或容量超负荷产生的靶器官反应，是一种极其重要的、独立的心血管危险因素，可使心肌缺血、心律失常、心力衰竭和猝死的几率增加6～10倍。本实验用异丙肾上腺素建立大鼠心肌肥厚模型〔2〕，建模10 d后通过病理学观察，模型组和干预组心肌细胞明显肥大，左室重量及左室重量指数均明显高于对照组。

ECM围绕在心肌细胞周围，可保护心脏功能及结构的完整性。心肌肥厚的过程主要包括心肌细胞的肥大和间质的纤维化，初期的心肌肥厚有一定的代偿意义，但随着心肌间质成纤维细胞的增殖，细胞外基质只要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维沉积异常增加，是心肌结构的功能发生重塑，最终导致冠脉血流储备减少，增加心肌缺血，从而引起心力衰竭、心律失常、猝死等。MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶，主要由胶原构成。MMPs的表达和活性增强，可导致正常心肌胶原蛋白过度降解，并被缺乏连接结构的纤维间质取代，使心脏组织重构，最终导致心功能恶化。MMP-1可降解变性的胶原，MMP-3可作用于Ⅲ型、Ⅳ型胶原及明胶。MMP-1和MMP-3的表达水平可间接反映心肌肥厚程度。

心肌重构过程中，RAAS发挥着很重要的作用，血管紧张素Ⅱ是RAAS中最重要的效应因子，可作用于间质细胞和心肌细胞启动重构。血管紧张素受体包含两种不同的亚型，AT1和AT2，AngⅡ作用于心肌细胞的AT1受体，使心肌细胞蛋白合成增加、心肌肥大，与心肌重塑相关基因的表达上调，同时还可促进心肌细胞的凋亡。AngⅡ作用于心脏成纤维细胞的AT1受体，诱导组织纤维化，胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成增加，从而刺激MMP-1和MMP-3的表达和活性增强，导致正常心肌胶原蛋白过度降解，心脏组织重构。ARB是AT1受体的无活性配体，可以与AngⅡ竞争AT1的结合位点〔3〕。因此，ARB药物的作用都是阻断RAAS，减少AngⅡ并抑制其与配体的结合，从而达到抑制心肌重塑的目的。本试验使用ARB类药物奥美沙坦对心肌肥厚大鼠进行干预，结果显示干预组的左室重量、心脏重量、左室重量指数均低于模型组，为奥美沙坦抗心肌肥厚机制提供了理论依据。

1 Berenji K，Drazner MH Rothermel BA，et al.Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure〔J〕?Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;289(1):H8-H16.

2 White P，Brestelli JE，Kaestner KH，et al.Identification of transcription networks during liver regeneration〔J〕.J Biol Chem，2005;280(5):3715-22.

3 马晓庆，苏胜偶.内皮素、血管紧张素Ⅱ、转化生长因子p1与心肌肥厚关系的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2009;9(6);767-8.