ECA109细胞对二甲基亚枫耐受剂量的分析

宋凤艳 (韩山师范学院生物系，广东 潮州 521041)

二甲基亚砜(DMSO)是一种性能优越的溶剂，在细胞培养的过程中，不仅是冻存细胞的冷冻剂，也是很多干预药物的常用载体［1］。一些研究表明，DMSO本身具有诱导癌症细胞分化、抑制生长和促进凋亡的作用［2-4］。在药理研究过程中，DMSO作为药物溶剂，控制好使用剂量，以免对药物自身的作用产生干扰就显得很重要。本研究以ECA109细胞株为对象，通过观察不同浓度DMSO干预下，细胞形态及生存率的变化，确定上述细胞株对该试剂的耐受剂量，为后续实验应用提供研究支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象:ECA109细胞株。

1.2 主要试剂:二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，DMEM高糖培养基，胰蛋白酶，胎牛血清，溴化乙锭(EB)，吖啶橙(AO)，上述试剂购自Sigma公司。

1.3 主要仪器:CO2培养箱(HE2RA cell150，Thermo公司)，超净工作台(Thermo公司)，倒置相差显微镜(Olympus BH-5，Olympus公司)，MC显微数码成像系统(广州市明美光电技术有限公司)，酶标仪(AD 340，Beckmann Coul2ter)。

1.4 细胞培养:分别取对数期生长的ECA109细胞株，胰酶消化后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释为单细胞悬液，细胞密度约为2×104/L。各以200 μl/L孔和1 ml/孔的剂量接种于96孔培养板和24孔培养板，在体积分数为5%的CO2和37℃条件下进行培养。

1.5 DMSO的干预:当细胞培养满24 h时，按照10个浓度梯度(2 ml/L、4 ml/L、6 ml/L、8 ml/L、10 ml/L、12 ml/L、14 ml/L、16 ml/L、18 ml/L、20 ml/L)依次加入预处理好的DMSO试剂，每个浓度梯度对应4个培养孔，继续培养。

1.6 MTT检测:干预后的24 h、48 h和72 h，分别取一块96孔板，小心吸出各孔培养液，再向各孔内加入无血清DMEM高糖培养基1 ml和5 g/L的MTT试剂10 μl，混合均匀，继续培养4 h。4 h后小心吸出培养液，向每个培养孔内加入纯净的DMSO试剂200 μl，震荡溶解20 min。以空白对照孔(无细胞)调零，在酶标仪上测定记录各孔吸光度值(490 nm)，计算各个浓度对应的细胞生存率。

1.7 细胞形态观察:干预后的24 h、48 h和72 h，分别取一块24孔板，AO/EB染色前后分别置于光学相差显微镜下，观察拍照记录细胞的形态变化。

2 结果

2.1 DMSO作用于ECA109细胞株后细胞生存率及IC50的计算结果:从图1可以看出，随着加入DMSO剂量的增加和作用时间的延长，该试剂对细胞的抑制作用逐渐明显。对ECA109细胞而言，8 ml/L浓度作用24 h时细胞生存率变化尚不明显，48 h时则有近10个百分点的下降，72 h时下降幅度已有20%。随着浓度的提高和作用时间的延长，DMSO对细胞生存率的影响明显加大，10 ml/L浓度作用24 h时细胞生存率下降已达10%。另外，对24～72 h三个时间点的结果彼此进行比较，差别都具有统计学意义(P﹤0.05)。

图1 DMSO作用于ECA109:细胞株后24～72 h细胞生存率检测结果

2.2 DMSO作用于ECA109细胞株后24～72 h三个时间点对应的IC50计算结果:由图3可以看出，ECA109细胞在24～72 h三个时间点对应的IC50(50%inhibiting concentration)值呈逐渐降低的趋势，24 h时为17.34 ml，48 h时为13.7 ml，而72 h时只有11.24 ml。

2.3 DMSO作用于ECA109细胞株后细胞形态学的变化:图3(图片a～f)是12 ml/L浓度的DMSO作用于ECA109细胞48 h后，倒置相差显微镜下观察到的多种细胞形态。从图中可以看出，正常ECA109细胞(图片a)呈现不规则的形状，细胞边界清晰，外观近似梭形。受DMSO干预后(图片b～f)，细胞发生收缩，体积变小，外形逐渐变圆，变形后的细胞聚集成团;部分细胞裂解，出现疑似凋亡小体的形态特征。

图片a1～f1是ECA109细胞经AO/EB染色后的影像特征，a1为对照组细胞，正常ECA109细胞外形不规则，有的呈多边形，有的近似梭形，细胞及细胞核边界清晰，染色均匀。b1～f1是12 ml/L浓度的DMSO干预后处在不同凋亡时期的细胞。从图中可以看出，细胞的胞质逐渐脱落，细胞收缩变圆，体积逐渐缩小，细胞核深染。AO/EB染色后，呈现不同程度的橘黄色和橘红色荧光(蓝色光激发)。细胞核边界逐渐模糊直至消失，最后细胞核与细胞质融合。

图2 DMSO作用于ECA109后24～72 h对应的IC50计算结果

图3 EDTA-Na作用于ECA109:细胞株48 h时观察到的细胞形态学特征(a为对照组细胞，b～f是未染色时倒置相差显微镜下观察到的ECA109细胞;a1是对照组细胞，b1～f1是AO/EB染色后的ECA109细胞)

3 结论

DMSO具有细胞毒性低、细胞膜亲和力高的特点，在一定的剂量范围内是比较理想的药物溶剂。综合本次的研究结果，可以得出以下结论:对于ECA109细胞而言，24 h内8 ml/L的浓度对细胞基本没有影响，作用时间如需延长至48～72 h，剂量最好控制在6 ml/L左右;DMSO对癌症细胞生长的影响具有剂量依赖性和时间依赖性，不同种类的癌症细胞对该物质的耐受性有所不同［5］，目前关于该方面的研究还非常有限，进一步的研究还很必要。

［1］ Melkonyan H，Sorg C，Klempt M.Elect reparation efficiency in mammalian cells is increased by dimethyl sulfoxide(DMSO)［J］.Nucleic Acids Research，1996，2(21):4356.

［2］ Koike M，Ishino K，Kohno Y，et al.DMSO induces apoptosis in SV402 transformed human keratin ocytes，but not in normal keratin ocytes［J］.Cancer Lett，1996，108(2):185.

［3］ 刘晓琴，郭 峰，张艳丽 .二甲基亚砜通过激活caspase23以及抑制PARP21引起A549细胞凋亡［J］.基础医学与临床，2010，30(6):566.

［4］ 谭立军，汤雪明.二甲基亚砜诱导人食管癌细胞分化的实验研究［J］. 实验生物学报，1998，31(4):353.

［5］ 吴 迪，巴哈尔古丽·卡哈尔，吴桂荣.溶媒二甲基亚砜对细胞生长与活力的影响研究［J］.新疆医科大学学报，2010，33(5):489.