电针对坐骨神经损伤大耳白兔脊髓前角组织中GAP-43的影响＊

王瑞辉 张秋红 屈红艳 杜 旭 陕西中医学院（咸阳 712046）

周围神经损伤是很常见的创伤性疾患，指周围神经丛、神经干或其分支受到外力作用，如锐器伤、牵拉伤、挤压伤等而发生的损伤。在人类的生活、劳动过程中均能发生，尤其是随着现代工业、交通运输业的迅猛发展，工伤和交通事故造成的周围神经损伤，包括坐骨神经及其分支损伤，发病率逐年升高，已成为常见病之一。显微外科的发展使周围神经损伤的手术修复明显提升，但解剖上的修复还不能完全解决患者的功能的恢复，一些患者遗留有感觉、运动功能障碍，严重影响工作和生活质量。临床针灸治疗能促明显进功能的恢复，但其治疗的机理还不是完全清楚，本实验通过动物实验观察电针治疗对坐骨神经损伤大耳白兔脊髓腰膨大组织中GAP-43含量的影响，以探索电针治疗本病的部分机理，为针灸治疗周围神经损伤提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用健康成年雄性大耳白兔48只，体重2±0.2kg，动物合格证号：SCXK（陕）2007-002。

1.2 主要试剂 兔抗兔GAP-43多抗（克隆号BA0878，武汉博士德生物工程技有限公司）；SABC免疫组化试剂盒（型号SA1022，武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色剂（型号AR1022，武汉博士德生物工程有限公司）

1.3 动物分组及造模 将购回的48只大耳白兔适应性喂养1周，按照体重从小到大排列，随机分为空白对照组、模型对照组、电针治疗组，每组16只。模型对照组和电针治疗组参照文献[1]造模，用螺旋测微仪卡口挤压坐骨神经，夹至0.15mm处保持60s，松开30s，再夹至0.15mm处保持60s（预实验中经病理切片HE染色证实造成坐骨神经SunderlandⅡ～Ⅲ度损伤），并于术后7d内，在动物下肢肌肉注射青霉素40万u，1d2次，进行抗感染处理。

1.4 处理方法 空白对照组：在室温20～25℃动物房内，让动物自由饮水及饮食，不做任何处理；模型对照组：造模成功后，与空白对照组相同条件下喂养，并模拟捉拿，但不施加电针治疗；电针治疗组：造模成功后，与空白对照组相同条件下喂养，并于造模后第2天实施电针治疗，选取相当于人体的“环跳”、“足三里”两个穴位，参考文献[2]定位，常规酒精消毒，选用32号的1寸毫针刺入，连接G6805-C治疗仪，选用疏密波，强度以针身微抖动为度，留针20min。1d1次，7d为1疗程，休息1d，开始下1疗程，共治疗2个疗程。分别于第1疗程与第2疗程结束后当天麻醉动物并取材备用。

1.5 观察指标与检测方法 GAP-43测定：在第1、2疗程结束后当日，每组各取大耳白兔8只，以造模同样方法麻醉后，剥除脊髓被膜取长度约为1cm的脊髓腰膨大段组织。所取组织置入4%中性甲醛溶液中，室温固定24h，第2日转入PBS缓冲液中待用。分批次进行脱水、浸蜡、石蜡包埋组织，以4um为厚度纵切组织，方法如下：①切片常规脱蜡至水：二甲苯Ⅰ5～10min→二甲苯Ⅱ5～10min→无水乙醇I 3～5min→无水乙醇II 3～5min→95%酒精3～5min→85%酒精3～5min→蒸馏水中浸泡3min。②热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），电炉加热至95℃后断电，间隔10min，反复2次。冷却后PBS（pH7.2～7.6）洗涤2min×2次。③30%H2O220mL以蒸馏水10倍稀释至3%H2O2200mL，室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水2min×3次。⑤滴加抗体稀释液1∶100稀释的兔多克隆抗兔GAP-43，4℃过夜，后于37℃温箱复温30min。PBS（pH7.2～7.6）洗2min×2次。⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG37℃1h。PBS洗2min×3次。⑦滴加试剂SABC，37℃20min。PBS（pH7.2～7.6）洗5min×4次。⑧DAB显色：取1mL蒸馏水，加DAB显色试剂盒中A，B，C试剂各加一滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，10～30min后蒸馏水洗涤终止反应。⑨苏木素中复染3～5s，水洗，镜下控制复染颜色。脱水，透明，中性树胶封片。⑩光镜下观察脊髓前角阳性细胞数，每只动物取3张切片观察，取其平均数作为该动物的阳性细胞数。

2 结 果

2.1 电针治疗1、2疗程后GAP-43表达的影响的检测结果见下表。

表1 第1和第2疗程结束后各组相应脊髓节段GAP-43阳性细胞数比较（个，）

表1 第1和第2疗程结束后各组相应脊髓节段GAP-43阳性细胞数比较（个，）

注：与空白对照组比较，◇表示P＜0.01；与模型对照组比较，△表示P＜0.01

第一疗程后 第二疗程后空白对照组组 别 n 8 0.00±0.00 0.00±0.00模型对照组 8 16.83±2.06◇ 6.37±1.41◇电针治疗组 8 24.16±1.78△ 13.55±1.66△

从上表中可以看出，第1、2个疗程后，模型对照组脊髓中GAP-43阳性细胞表达数均高于空白对照组，差异有显著性意义（P＜0.01），说明大耳白兔坐骨神经急性损伤后脊髓相应节段中的GAP-43表达增加；电针治疗组脊髓中GAP-43含量高于模型对照组，差异有显著性意义（P＜0.01），说明使用电针治疗能增强脊髓相应节段中GAP-43的表达水平。

各组实验切片检测显示空白对照组在第1和第2疗程结束后GAP-43无明显表达；而模型组和电针治疗组在第1和第2疗程结束后GAP-43均有明显表达，而且以电针组表达更为显著（见图1～5）。

3 讨 论

坐骨神经损伤临床症状与中医“痿证”的表现相似。早在《内经》中就已经有了“治痿独取阳明”的记载。本实验选取“足三里”以调其阳明经之气血，环跳穴属足少阳胆经穴，是胆经与足太阳膀胱经交会穴，用之可疏通经络、行气活血，是治疗下肢痿痹的要穴。两穴配合使用，可疏经活络，补益气血，改善肌肉营养，促进神经功能恢复。

GAP-43是一种分子量为24KD的钙调蛋白结合的胞膜磷酸蛋白质。80年代初由Skene等[3]人首先从兔再生的外周神经中获得，被认为是神经元再生和发育的一个内在决定因子。GAP-43在神经系统的生长、发育、再生、修复和突触可塑性中起着重要作用，GAP-43可能是在神经元生长过程中靠改变生长锥中的G蛋白活性，影响轴突生长。如果生长锥中的G蛋白与其受体反应产生抑制信号，就会导致生长锥停止生长。而GAP-43与生长锥中的G蛋白结合后，这种抑制信号被解除，轴突就会继续生长[4]。目前尚不清楚GAP-43表达的调控机制，推测其表达可能与转录后的调节密切相关。

周围神经损伤后，GAP-43含量可增加20～100倍[5，6]，国际上已将其列为研究神经生长发育和损伤修复等的首选分子探针。增强损伤脊髓或神经组织中GAP-43的表达水平，能促进损伤组织中神经元的再生和修复，对损伤组织起保护作用。张奇兰[7]等研究发现GAP-43在脊髓损伤后24h即开始阳性表达，5～7d时达高峰，损伤后2周开始下调，提示GAP-43参与脊髓损伤后神经的再生修复与功能的恢复。

本课题研究结果发现，在大耳白兔坐骨神经急性损伤后，模型对照组其脊髓腰膨大中GAP-43，7d时表达水平较高，14d时逐渐降低；而电针治疗组GAP-43水平，7d时表达较模型对照组高，14d时仍保持在较高水平。说明电针能增强坐骨神经损伤后脊髓相应节段组织中GAP-43的表达。这也许是因为电针通过刺激促使神经元胞体合成更多的GAP-43，以结合到更多的G蛋白反应位点，促进生长锥延伸和轴突快速生长，从而促进损伤神经的修复和再生。

[1]屈红艳，王瑞辉，刘飞虎.电针对家兔坐骨神经损伤后IL-1β的影响[J].陕西中医，2007，28（4）：506.

[2]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：415.

[3]Skene JHP.Axonal growth associated proteins[J].Annu RevNeurosci，1989，12：127.

[4]McIlvain VA，Robertson DR，Maimone MM ，et al.Abnormal thalamocortical path finding and terminal arbors lead to enlarged barrels in neonatal GAP-43heterozygous mice[J].J Comp Neurol，2003，21：252-264.

[5]Carrasco J，Penkowam，Giraltm，et al.Role of metallothionein-III following central nervous system damage [J].Neurpbol Dis，2003，13（1）：22-36.

[6]Mcllvanva，Robertson Dr，Mamonemm，et al.Abnormal thalamocortical path finding and them inalarbors lead to enlarged barrels in neonatal GAP-43heterozygous mice [J].J Comp Neural，2003，462（2）：252-264.

[7]张奇兰，李俊岑，丁培培，等.神经生长相关蛋白GAP-43在脊髓损伤后不同时段的表达[J].四川解剖学杂志，2010，18（2）：1-3.