倒卵叶五加及复方佳蓉片对衰老大鼠睾丸间质细胞Bcl-2、Bax的作用＊

谢艳华 杨 倩 周暄宣 朱爱华 同卓斌 张芳霞 王四旺 第四军医大学药学院天然药物学教研室（西安 710032）

研究表明细胞凋亡通过破坏重要的不能再生的细胞对衰老起负面影响[1]，伴随衰老的发生，心肌、脑组织、肾上腺等多种组织器官的细胞凋亡过度增加[2]，推进衰老进程。衰老可使睾丸间质细胞Bax蛋白表达增强和Bcl-2蛋白表达降低，将诱导睾丸组织细胞凋亡[3]。倒卵叶五加具有健脾益气、补肾宁心、舒筋活络的功能，适用于体虚乏力，食欲不振，腰膝酸软，阳痿，失眠多梦，健忘，风寒湿痹等。我们前期研究证实，倒卵叶五加和佳蓉片可抑制衰老大鼠抗氧化能力的降低，具有明显延缓衰老的作用；机制可能与其抗氧化和降低衰老大鼠睾丸组织中NO和iNOS的含量有关[4－5]。本实验旨在进一步探讨倒卵叶五加和佳蓉片对亚急性衰老大鼠睾丸间质细胞Bcl-2、Bax的影响。

1 材料与方法

1.1 试 剂 D-半乳糖，批号201112B09，北京化学试剂公司，采用生理盐水配成6%的溶液。倒卵叶五加浸膏，含生药量3.8g／g浸膏，批号2011091201，由宝鸡饮片厂出品；佳蓉片，批号201111032，陕西博爱制药有限公司出品。

1.2 实验动物 SD大鼠，8周龄，雄性60只，体重200～250g，由第四军医大学实验动物研究中心提供，动物合格证号：SCXK（军）字第2007-007号。实验环境为SPF级。动物随机分为正常组、模型组、倒卵叶五加组、佳蓉片组、维生素E组，每组12只大鼠。D-半乳糖连续腹腔注射（320mg／kg，50d）建立亚急性衰老大鼠模型，各组大鼠在腹腔注射D-半乳糖（正常组动物注射等量生理盐水）的同时，正常和模型组大鼠灌胃生理盐水（10mL／kg）、其他各组依次给予倒卵叶五加（1g／kg）、佳蓉片（6g／kg）、维生素E（20mg／kg），用药50d。

1.3 标本采集与处理 各组大鼠末次给药后眼内眦取血2mL后，行左心室快速灌注DEPC处理的生理盐水约250mL，取睾丸组织用多聚甲醛固定、石蜡包埋、免疫组化染色。

1.4 血清睾酮测定 取血样本，1200rpm／min离心15min，上清液于－20℃冰箱保存备用。按试剂盒方法测定血清睾酮含量。

1.5 免疫组织化学 按照SP方法操作。细胞内出现棕黄色颗粒为阳性结果，每组至少计数10只大鼠，每只大鼠计数5张切片，通过Imageproplus图像分析软件测定每张切片中的10个视野阳性细胞的平均光密度（MOD）值，计算平均值，代表蛋白表达量。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS17.0统计软件进行分析，所有数据以（）表示，组间资料应用单因素方差分析，组间比较采用S-N-K法检验，P＜0.05表示差异有显著意义；P＜0.01表示差异有非常显著意义。

2 结 果

2.1 血清睾酮浓度 结果见表1。倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E各组大鼠血清睾酮浓度较模型组明显升高，其差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），表明D-半乳糖致亚急性衰老大鼠血清睾酮浓度明显下降。

表1 血清睾酮浓度测定结果（ng／mL，）

表1 血清睾酮浓度测定结果（ng／mL，）

注：与模型组比较△P＜0.05，▲P＜0.01

组 别 n 剂量（mg／kg） 血清睾酮含量正常组 12 等量NS 15.562±0.325△模型组 12 320 14.916±0.489倒卵叶五加 12 1000 15.425±0.328△佳蓉片 12 6000 15.327±0.419△维生素E 12 20 15.892±0.431▲

2.2 免疫组化结果 表2显示，模型组大鼠睾丸间质细胞中Bcl-2蛋白阳性表达为棕黄色；倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E各组的阳性表达明显高于模型组，其差异均具有显著或非常显著意义（P＜0.05或P＜0.01）。Bax结果显示倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E各组的阳性表达明显低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠睾丸间质细胞Bcl-2和bax蛋白阳性表达结果（MOD值，）

表2 各组大鼠睾丸间质细胞Bcl-2和bax蛋白阳性表达结果（MOD值，）

注：与模型组比较△P＜0.05，▲P＜0.01

组 别 n Bcl-2 Bax正常组 12 0.4785±0.0036▲ 0.4756±0.0048▲模型组 12 0.3891±0.00440.5459±0.0053倒卵叶五加 12 0.4543±0.0045▲ 0.4701±0.0043▲佳蓉片 12 0.4452±0.0041△ 0.4815±0.0040△维生素E 12 0.4521±0.0052△ 0.4801±0.0052△

3 讨 论

细胞凋亡（appoptosis）的分子和生化机制迄今尚不完全清楚，但多数学者认为其形成主要与Bcl-2基因家族相关。细胞调亡进程一般分3个时相，即诱导期，效应期和降解期。诱导期的细胞在接受各种外来信号引发效应；进入效应期决定细胞存活或死亡的分子调控，调控分子包括原癌基因和抑癌基因，其中Bcl-2家族起着决定作用；到了降解期可见到凋亡现象。Bcl-2是一种原癌基因，由Tsujimoto等人在人淋巴瘤细胞中克隆得到，是线虫抑凋亡基因CED-9的同源物，目前发现有三十多个成员，发挥着凋亡监测作用。Bcl-2家族蛋白分为三个亚家族；抑凋亡蛋白家族包括 Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1等真核细胞蛋白以及 E1B-19、BHRF1、KS-Bcl-2等病毒蛋白，促凋亡蛋白家族包括Bax亚家族和BH3-only亚家族。Bcl-2及其类似物Bcl-xl、Bcl-w能抑制多种刺激引起细胞凋亡，它们定位于线粒体外膜、内质网膜和细胞核膜上，Bcl-2通常位于膜上而Bcl－w和Bcl-xl则在细胞受到凋亡刺激时通过构象变化结合到膜上[6]。

Bax和Bak研究的较多，主要通过线粒体或内质网凋亡途径发挥作用。在正常细胞中Bax位于胞浆以单体可溶性蛋白形式存在，在接受凋亡刺激后Bax发生构象变化插入线粒体外膜，形成多聚体；Bak通常位于线粒体膜上，当凋亡发生时也发生构象变化引起多聚体形成。

Bcl-2蛋白在细胞中过量表达时，可与全部Bax结合，细胞成活，凋亡抑制。但当Bax过量存在，与Bcl-2形成异源二聚体，则细胞凋亡。哺乳动物睾丸内Bcl-2和Bax表达及比值变化，睾丸细胞凋亡数随之变化，结构和功能将出现异常[7－9]。本研究结果显示应用倒卵叶五加和佳蓉片干预后Bcl-2蛋白的表达增加；Bax蛋白的表达减少；且倒卵叶五加组效果最好，说明倒卵叶五加可以调节凋亡蛋白的表达，抑制睾丸间质细胞的凋亡，减轻D－半乳糖所致亚急性衰老模型大鼠睾丸间质细胞的损伤。

[1]Wamer HR，Ho des RJ.What does cell death have to do with aging？[J].J Am Geriatr Soc，1997，45（10）：1140-1146.

[2]Geng YJ，Ishikawa Y，Vatner DE，et a1.Apoptosis of cardiacmyoeytes in Gsalpha transgenic mice[J].Circ Res，1999，84（1）：3442.

[3]郭 银，牛嗣云，高 福，等.何首乌饮对过度训练大鼠睾丸间质细胞Bcl-2、Bax的影响[J].时珍国医国药，2012，23（3）：589-590.

[4]杨 倩，谢艳华，周暄宣，等.倒卵叶五加及其复方对大鼠的抗衰老作用[J].中国医药导报（已录用，待发表）.

[5]田振军，林琴琴，党利农.运动训练对大鼠睾丸组织NOS、Bax、Bel-2表达的影响[J].西安体育学院学报，2007，24（1）：63.

[6]Youle RJ.Strasser A.The Bcl-2Protein family：opposing activities that mediate cell death[J].Nat Rew Mol Ceel Biol，2008，9（1）：47.

[7]陈 伟，舒小林，陆 祥，等.As2O3对大鼠生精细胞凋亡及其 Bcl-2／Bax表达的变化[J].中国中药杂志，2008，33（23）：2823.

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[9]Kim KH，Joo KJ，Park HJ，et a1.Nicotine induces apoptosis in TM3mouse Leydin cells[J].Fertil Steril，2005，83（1）：1093.