益气活血方对早期DN大鼠肾脏TGF-β1／Smads表达的实验研究＊

苏衍进 王郁金 马居里 雷根平 林 源 陕西中医学院（咸阳 712046）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的微血管并发症之一。糖尿病（diabetes mellitus，DM）病程10年以上者约50%并发DN，在每年新增终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）中，DN所占比例逐年升高。现代医学治疗糖尿病肾病疗效较差，而中医药多靶点治疗疗效越来越显著。故目前中医药在糖尿病肾病方面研究成为当前研究的热点。

导师马居里教授长期从事糖尿病肾病临床及科研工作，认为该病病机多端，但其关键在于气虚血瘀，“气虚”是本，“血瘀”是标，本虚标实，故气虚血瘀是本病的根本病机，瘀阻肾络则是糖尿病肾病的病理核心。根据上述病机，自拟益气活血方[1]治疗多例患者，临床疗效较好，为进一步探讨其作用机理，本课题通过动物实验，从药效和机理方面对自拟益气活血方治疗早期DN进行研究。具体研究结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验药物 自拟益气活血方组成：黄芪30g，丹参20g，苍术、生薏苡仁各12g，当归、玄参、川朴各10g。购自陕西中医学院第一附属医院中药房。盐酸贝那普利片（洛汀新）：规格10mg／片；批号：H20030514。由北京诺华制药有限公司生产。

1.2 动 物 SD雄性大鼠共计82只，7周龄，体重200.46±13.95克／只。西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.3 试 剂 链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司），尿微量白蛋白ELTSA试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗大鼠Smad2多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗大鼠Smad7多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.4 仪 器 日立全自动生化分析仪（日本日立公司），JB-L6组织包埋系统（武汉俊杰电子有限公司），图像采集系统（NIKON.ACT-1DXM1200），日本尼康公司 Bio-Tek ELX808吸收光酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），BK1301生物显微镜（重庆光学仪器厂）。

1.5 方 法 大鼠适应性喂养1周后，随机分成两大组，即A组（正常对照组10只），另72只大鼠依据文献复制模型[2]，成功造模后死亡3只，剩余69只，将造模成功大鼠随机分为糖尿病肾病模型组（12只）、贝纳普利组（12只）、自拟益气活血方小剂量组（15只）、自拟益气活血方中剂量组（15只）、自拟益气活血方大剂量组（15只）。中药大剂量组予以剂量22.6g／kg·d；中剂量组给予11.3g／kg·d灌胃，小剂量组大鼠给予5.65g／kg·d灌胃；贝那普利组予以1.04mg／kg·d灌胃。正常对照组以同样的方法，予以等量生理盐水。造模成功后1周开始给药，每天上午给药1次，不间断给药11周。整个实验期间，没有使用胰岛素及其它降糖。所有大鼠分别于0、6、12周末测24h尿量并保存，以备检测尿微量白蛋白（用ELISA检测）。第12周取肾皮质组织行HE染色、Masson染色步骤，采用酶免疫组织化学SP二步法检测肾组织中TGF-β1、Smad2、Smad7表达。数据以均数±标准差表示（），采用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析，两组间差异采用LSD法进行组间差异显著性检验，方差不齐者采用Tamhane，sT2检验。P＜0.05差异有统计学意义，P＜0.01差异有显著性统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠24h尿微量白蛋白定量变化 糖尿病肾病组与正常组尿微量白蛋白定量比较，第6周、第12周有统计学差异，贝纳普利组及自拟益气活血方各组与糖尿病肾病组比较有统计学差异。自拟益气活血方大剂量组较中小剂量组比较有统计学差异。结果见表1。

表1 各组大鼠24h尿微量白蛋白定量变化比较（mg／24h，）

表1 各组大鼠24h尿微量白蛋白定量变化比较（mg／24h，）

注：与正常对照组相比◇P＜0.05，◆P＜0.01；与自拟益气活血方（5.65mg／kg）组相比△P＜0.05，▲P＜0.01

组 别 剂量（mg／kg） n 0周 6周 12周10 1.47±0.68 1.32±0.81 1.74±0.46糖尿病肾病模型 ／ 12 1.36±0.71 16.57±5.86◇ 33.47±10.51◇贝纳普利 1.04 12 1.41±0.69 14.99±4.30 20.76±4.76自拟益气活血方 5.65 15 1.39±0.38 14.27±5.30 18.39±4.91自拟益气活血方 11.30 15 1.32±0.35△ 14.89±4.27△ 17.56±3.52△自拟益气活血方 22.60 15 1.35±0.46▲◆ 13.76±3.32▲◆ 13.45±4.38正常对照 ／▲◆

2.2 12周末各组大鼠肾脏 TGF-β1、Smad2、Smad7表达贝纳普利组、自拟益气活血方小剂量组与糖尿病肾病组比较，肾皮质TGF－β1、Smad2表达明显下降，Smad7表达明显升高；且大剂量较中小剂量组效果更好。结果见表2。

表2 12周末各组大鼠肾脏TGF-β1、Smad2、Smad7表达比较（）

表2 12周末各组大鼠肾脏TGF-β1、Smad2、Smad7表达比较（）

注：与糖尿病肾病组比较△P＜0.05，▲P＜0.01；与自拟益气活血方小剂量组比较◇P＜0.05，◆P＜0.01

Smad2 Smad7正常对照 ／ 10 2.00±1.05▲ 2.10±0.99▲ 5.86±1.03组 别 剂量（mg／kg） n TGF-β1▲糖尿病肾病模型 ／ 12 5.85±1.14 6.58±1.24 2.08±0.79贝纳普利 1.04 12 4.16±1.21△ 4.23±1.69△ 3.84±1.68△自拟益气活血方 5.65 15 4.09±1.42△ 4.04±1.71△ 3.92±1.55△自拟益气活血方 11.30 15 3.65±1.36◇ 3.25±1.56◇ 4.28±1.24◇自拟益气活血方 22.60 15 2.64±0.82◆ 2.98±1.36◆ 5.34±1.36◆

3 结 论

自拟益气活血方能够减少早期糖尿病肾病24小时尿微量白蛋白排泄。

自拟益气活血方能减少早期DN模型大鼠肾组织TGF－β1、Smad2的表达，上调Smad7的表达，继之延缓肾脏纤维化，延缓DN的进展，且大剂量组较中小剂量组效果更好。

4 讨 论

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最重要和最常见的并发症之一，在终末期肾衰竭患者中约三分之一是由DN引起的，DN成为糖尿病病人的主要死亡原因之一。其发生机制较为复杂，研究表明细胞因子是糖尿病肾病发生、发展重要因素之一；诸多细胞因子中以促进肾脏细胞发生细胞肥大、增加系膜细胞细胞外基质产生的TGF-β1为核心因子，是DN发病机制的最后共同通路[3，4]。此外，研究表明Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受体胞内激酶底物，介导TGF-β的胞内信号传导过程[5]，而 Smads[6－8]有9种，其中主要以 Smad2、Smad7参与TGF-β1信号转导。

DN属“消渴”、“消肾”等范畴，本质是“本虚标实，虚实夹杂”之证，是消渴病气阴两虚的发展。消渴病，早期阴虚为本，燥热为标，渐病久阴虚及气，而成气阴两虚之证，中期燥热渐减，气虚而运血无力，阴虚继而血行艰涩，血液运行不畅则瘀阻经脉，形成气虚血瘀证候。“气虚血淤”贯穿于DN发展的全过程，导师马居里教授根据此病机以益气活血为则，自拟益气活血方治疗多例糖尿病肾病患者获较好疗效。现代药理研究表明：黄芪能有效降低血小板活化程度，降低血小板的聚集性，减少血栓形成，改善血液高凝状态。丹参可以通过扩张血管、加快血液流速，从而消除血液淤滞改善微循环，达到“血行则水行”，当归有降低血脂、抑制大鼠血小板聚集、抑制小鼠血小板炎性物质的释放等作用。苍术，增加小鼠血清中的超氧化物歧化酶（SOD）的含量。玄参，能显著竞争性抑制醛糖还原酶的活性，使高血糖条件下多元醇的代谢过程受到抑制，从而减少了山梨醇在在肾组织的聚集延缓DN的发展。川朴，具有抑制血小板凝集的作用，降低胆固醇作用。

本研究表明，24h尿微量白蛋白定量，大、中、小中药剂量组较糖尿病肾病模型组明显下降，且中药大剂量组较中、小剂量组疗效更好，中小剂量组之间无显著性差异，大剂量组与贝纳普利组比较有显著性差异（P＜0.05），第6周中药各组及贝那普利组之间无显著性差异（P＞0.05）；酶免疫组化结果显示，大、中、小中药组与贝那普利组TGF－β1、Smad2在肾脏表达均低于模型组（P＜0.05），且大剂量中药组与贝那普利组比较有显著性差异；大、中、小中药组与贝那普利组Smad7在肾脏的表达均高于模型组（P＜0.05），且大剂量中药组与贝那普利组之间有显著性差异（P＜0.05），中药中剂量与小剂量组之间无显著性差异（P＞0.05）。

综上所述，自拟“益气活血方”对糖尿病肾病治疗作用机制可能为：①改善肾脏微循环、增加肾血流量，降低血液粘稠度，改善肾小球基底膜通透性，进而对肾小球基底膜电荷屏障及机械屏障有保护作用，从而使尿中微量白蛋白减少。②调节细胞因子 TGF－β1、Smad2、Smad7表达，继之抑制 TGF－β1／Smads信号转导通路的激活，达到延缓肾小球纤维化、硬化，有效保护肾脏。

[1]苏衍进，王惠玲，王郁金.糖肾Ⅰ号胶囊治疗早期糖尿病肾病30例[J].中医杂志，2010，51（12）：1106-1107.

[2]胡怡秀.糖尿病肾病动物模型研究进展[J].国外医学卫生学分册，2008，35（6）：338-342.

[3]Ziyadeh FN.Mediators of diabetic renal disease：the case of tgf-Beta as the major mediator[J].Journal of the Ameri-can of Society of NePhorlogy，2004，15SuPP11：S55-7.

[4]刘志红，黎磊石.糖尿病肾病发病机理[J].中华肾脏病杂志，1999，15（2）：120-123.

[5]Deryncrk R，Zhnag YE，Smad-depended and Smad-independed Pathway in TGF-beta family singalling[J].Nature，2003，425（6958）：577-584.

[6]DerynckR，ZhangY，FengXH.Smads：Transcriptional activators of TGF-betaresponses[J].Ce11，1998，95：737-740.

[7]PiekE，HeldinCH，DijkePT.Specificity，diversity，and regulation in TGF-βsuperfamily signaling[J].FASEB J，1999，13：2105-2124.

[8]Heldin CH，Miyazono K，Dijke P.TGF-beta signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins[J].Nature，1997，390：465-471.