何首乌生品及不同炮制品中大黄素含量测定＊

黄玉剑 王秦勇 丁 瑾 卫培峰 陕西省渭南职业技术学院（渭南 714000）

何首乌始载于《开宝本草》，为蓼科蓼属植物何首乌（Polygonummultiflorum Thunb）的块根，经过炮制后具有补益精血，固肾乌须之功，该药历来为古今医家、饮食家所推崇，近几年来许多补血类中成药、保健食品中均将制首乌作为主要成分之一，应用较为广泛。近几年国内外报道[1]的何首乌不良反应日渐增多，且主要集中在肝脏不良反应，因而何首乌安全性问题引起国内外学者们的高度关注。相关文献报道[2]，何首乌中大黄素可能为何首乌的毒性成分，而该成分与炮制方法关系密切，因此本文就何首乌生品及不同炮制品中大黄素进行测定，以探讨分析不同何首乌炮制品致肝损伤的潜在风险。

1 实验材料

1.1 仪器高效液相色谱仪（Lab Alliance型恒流泵；Waters966二极管阵列检测器；活德国际贸易（上海）有限公司；Millennium 32色谱工作站）、C18色谱柱（Diamosil 4.6×250mm，5μm）、BP211D型分析天平（德国赛多利斯）、TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）、FOEA26810D型纯水机（Millipore公司）。

所用化学试剂为分析纯（天津富宇化学试剂厂）、液相用试剂为色谱纯（美国Fisher scintific）。

1.2 药 材 实验所需何首乌来自陕西省药材市场，产自四川。经鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根。按照2010版《中国药典》和《本草纲目》的方法炮制何首乌。

2 实验方法

2.1 何首乌水提物的制备 取何首乌生品及不同炮制品饮片各30g，煎煮提取，第1次加8倍量水，提取1h，倾出提取液，残渣再加6倍量的水，提取1h，合并2次提取液，水浴蒸干，真空干燥，即得，保存备用。

2.2 何首乌水提物供试溶液的制备 取何首乌生品及不同炮制品水提物粉末0.2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称重（准确至0.001g），水浴回流1h，取出，放冷，称重，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液作为测定游离型蒽醌的供试品溶液。

2.3 何首乌醇提物供试溶液的制备 取何首乌生品及不同炮制品细粉（过4号筛）0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称重（准确至0.001g），水浴回流1h，取出，放冷，称重，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液作为测定游离型蒽醌的供试品溶液。

2.4 对照品溶液的配制 分别精密称取大黄素、大黄酚和大黄酸标准品适量，用甲醇分别配成质量浓度为0.0605mg／mL的大黄素标准溶液、0.0644mg／mL的大黄酚标准溶液和0.0996mg／mL大黄酸标准溶液。

2.5 色谱分析条件 参照高效液相色谱法（附录ⅥD）测定，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Diamosil（4.6×250mm，5μm、NO：6004988）；以甲醇-0.1%磷酸（85：15）为流动相；流速：1.0mL／min；检测波长：254nm；柱温：室温，进样量：10μL。理论塔板数按大黄素峰计算不低于3000。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系的考察：分别精密量取贮备液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL进样，测定峰面积，以大黄素对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程得：y＝4E＋06x－15524（R2＝0.9997）。结果见表1。

表1 大黄素线性关系考察

结果表明：在0.121～0.726μg范围内，大黄素峰面积y与进样量x（μg）线性关系良好。

2.6.2 精密度试验：精密吸取样品溶液10μL，重复进样6次，测定大黄素峰面积。结果见表2。

表2 精密度结果

结果表明：精密度良好。

2.6.3 稳定性试验：精密吸取何首乌生品供试品溶液10μL，重复进样6次，测定大黄素峰面积。结果见表3。

表3 稳定性结果

结果表明：供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验：按拟定的含量测定条件及方法，取同一批号样品供试液，平行称取6份进行含量测定。结果见表4。

表4 重复性结果

结果表明：重复性良好。

3 样品测定

分别取何首乌生品及不同炮制品水提物样品和何首乌生品及不同炮制品粉末，按“何首乌水提物供试溶液的制备”方法和“何首乌醇提物供试溶液的制备”方法制备供试溶液。按上述色谱条件，10μL注入色谱仪，按外标法计算何首乌生品及不同炮制品水提物和醇提物中游离蒽醌的含量。结果：样品中未检测出大黄酸与大黄酚。见表5，图1-7。

表5 何首乌生品及不同炮制品大黄素含量测定结果

图1 大黄素标品HPLC图谱

图2 大黄酸标品HPLC图谱

图3 大黄酚标品HPLC图谱

图4 何首乌生品水提物HPLC图谱

图5 何首乌生品醇提物HPLC图谱

图6 何首乌九蒸九晒水提物HPLC图谱

图7 何首乌九蒸九晒醇提物HPLC图谱

4 结 果

本实验采用HPLC法检测何首乌生品及不同炮制品中大黄素含量，结果显示：何首乌生品及不同炮制品水提物与醇提物中均含有大黄素，其水提物中清蒸何首乌大黄素含量最高，九蒸九晒何首乌含量最低，醇提物中生品何首乌大黄素含量最高，九蒸九晒何首乌大黄素含量最低。所有样品未能检测出大黄酸与大黄酚。实验结果表明：九蒸九晒之何首乌蒸制时间较长，大黄素含量最低；而现代清蒸、黑豆汁制法时间较短，因而大黄素含量较高；而何首乌生品未经系统炮制，大黄素含量最高。

5 讨 论

目前多数学者认为，蒽醌类成分可能为何首乌中导致药物性肝脏损伤的主要毒性成分[3]。卫培峰等[4]在何首乌不同成分与肝细胞凋亡相关性研究中，将何首乌中蒽醌类成分提取物以及制首乌分别按不同剂量给予大鼠每天灌胃1次，连续3个月，检测大鼠肝脏细胞凋亡情况，结果显示，给药组与空白对照组比较，细胞凋亡指数明显增高。胡锡琴等[5]通过制何首乌对大鼠的长期毒性实验发现，给药组对大鼠肝脏转氨酶AST、ALT、ALP在不同阶段均有一定的影响，对大鼠肝脏有一定的毒副作用，但属于可逆转损伤。谭凯丽等[6]通过文献再评价认为，何首乌代谢产物可引起肝细胞脂质过氧化致肝细胞坏死。而大黄素则为蒽醌类主要成分之一，因此根据大黄素含量测定结果可以推测，何首乌生品导致肝损伤的风险最高，而九蒸九晒组最低。而古代本草文献之所以未记载有关制首乌导致药物性肝损伤病例的发生，很可能与使用九蒸九晒后蒽醌类成分大幅度降低有关。

[1]俞 捷，谢 洁，赵荣华，等.何首乌肝脏不良反应研究进展[J].中草药，2010，41（7）：1206-1210.

[2]孙桂波，纪凤兰，徐惠波，等.何首乌的化学成分与药理作用研究进展[J].长春中医药大学学报，2007，23（4）：105-106.

[3]方红玫，朱廷焱.何首乌有效成分、毒性作用和相关研究进展[J].国际药学研究杂志，2010，37（4）：283.

[4]卫培峰，党艳丽，焦晨莉，等.何首乌不同成分与肝细胞凋亡的相关性研究[J].陕西中医，2009，30（2）：238-239.

[5]胡锡琴，杨晓青，邢玉瑞，等.制何首乌致肝损害的实验研究[J].陕西中医，2006，27（5）：625-626.

[6]谭凯丽，廖海民.何首乌的药理作用研究进展[J].山地农业生物学报，2010，29（1）：72-75.