农杆菌子房注射法对金钗石斛的活体转化研究

刘其府 ，董 会 ，曾宋君 ，陈之林 ，吴坤林 ，张建霞，段 俊

(1 中国科学院 华南植物园，华南农业植物遗传育种重点实验室，广东 广州 510650;2 中国科学院大学，北京 100049;3 华南农业大学 生命科学学院，广东 广州 510642;4 贵州园艺研究所，贵州 贵阳 550006)

金钗石斛Dendrobium nobile 为兰科Orchidaceae石斛属植物，分布于我国和东南亚等地，其花色艳丽，花姿优美，清香优雅，是著名的观赏花卉［1］.以其为直接亲本在英国皇家园艺学会登录的杂交种有109 个［2］.同时，金钗石斛又是珍贵药用植物，其化学成分有生物碱、酚类和多糖等，具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、抗白内障和抗菌等作用［3］.

农杆菌介导转化方法目前已经广泛应用在双子叶植物和水稻、小麦、玉米等一些单子叶植物上［4-5］，这些转化大多建立在成功的转化体系上.但兰科植物和其他的单子叶植物一样，受伤后不能产生酚类物质而不易感染农杆菌［4］，同时，大部分兰科植物离体诱导愈伤组织有一定难度，难以建立有效的转化体系，限制了农杆菌介导转化方法在兰科植物上的广泛应用.花粉管通道法已成功用于玉米、小麦、甜瓜、棉花和黄瓜等农作物的转基因育种工作［6-8］.将此方法应用到兰科植物目前还鲜见报道，主要原因可能是兰科植物从授粉到受精一般需要数十天的时间，质粒通过花粉管通道从柱头至子房时间太长，易降解.本研究采用工程化农杆菌直接注射金钗石斛子房，对其进行遗传转化，结合了花粉管通道法操作简单和农杆菌转化过程机理明确的优点，既不依赖于建立有效的遗传转化体系，同时又利用了农杆菌对植物侵染的高效性优势，不失为兰科植物转基因育种的有效方法.

1 材料与方法

1.1 材料

根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens EHA105，含有携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因(GUS)和潮霉素抗性基因(hpt)的质粒pCAMBIA1301.

金钗石斛种植于中国科学院华南植物园温室大棚.

1.2 菌液的准备

挑选农杆菌菌株EHA105(pCAMBIA1301)单菌落于含50 mg·L-1卡那霉素、50 mg·L-1硫酸链霉素的YM 液体培养基中，28℃条件下.120 r·min-1振荡培养至D600nm达到0.4～0.6，取1.5 mL 菌液4 000 r·min-1离心，去上清液，然后用10 mL AAM +200 μmol·L-1AS 活化培养基悬浮，120 r·min-1振荡培养1 h 后可应用于子房注射［10］.

1.3 子房注射方法

在温室中对金钗石斛进行人工自花授粉，分别在授粉后的10、20、30、40、45、50 和60 d 进行子房注射，每次注射25 mL 菌液，每个处理5 次重复，菌液现配现用.注射时，选择发育较好的子房，利用微量注射器在垂直于子房长度的方向将活化的农杆菌溶液注射子房内部.注射后对金钗石斛蒴果挂牌，待授粉后150 d 摘取果实并进行无菌播种.设人工自花授粉后未注射菌液的5 个果实为对照.

1.4 种子GUS 组织化学检测和无菌播种

由于pCAMBIA1301 中含有GUS 基因，采用GUS组织化学检测，方法参照文献［9］，操作时，采集授粉150 d 的成熟金钗石斛果实，先用体积分数为75%的乙醇擦洗果荚，然后放入质量浓度为1 g·L-1的升汞中浸泡消毒，10 min 后取出果荚，用无菌水冲洗3次，再用消毒后的手术刀将果荚剖开，取出注射部分的种子，一部分浸入适量的GUS 染液，37℃暗处保温6 h 后进行乙醇脱色，观察并拍照［9］，另一部分用于无菌播种.播种时，先将种子放入灭菌的三角瓶内，加质量浓度为6 g·L-1的次氯酸钠浸泡20 min，用无菌水冲洗3 次，过滤后将种子播于本实验室发明的N16 花宝培养基(花宝1 号1.5 g·L-1+蛋白胨2 g·L-1+活性炭1.5 g·L-1+B5培养基的维生素+萘乙酸1.0 mg·L-1+蔗糖15 g·L-1+椰子汁50 mL·L-1)［12］，放于温度28℃，光照强度1 600～2 000 lx 的培养室进行培养，每天光照16 h.每个果实播3 瓶.每瓶约300 粒种子.

1.5 原球茎的抗性筛选

将种子萌发45 d 后形成的原球茎转接至含潮霉素30 mg·L-1的选择培养基上培养，15 d 后将存活的原球茎转接至潮霉素质量浓度为40 mg·L-1的培养基上继续培养，15 d 后再将存活的原球茎转接至潮霉素质量浓度为50 mg·L-1的培养基上培养，再过15 d 将存活的原球茎转至无潮霉素的N16 培养基上培养［10］.

1.6 幼苗GUS 组织化学染色

对获得的11 株抗性植株进行GUS 染色，方法同种子GUS 组织化学检测.

1.7 抗性植株的PCR 检测

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法分别提取抗性株和对照植株基因组DNA，以pCAMBIA1301质粒为阳性对照，对照植株为阴性对照［10］.根据hpt基因设计引物:HPT-L，5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3';HPT-R，5'-GTGCTTGACATTGGGGAGTT-3'［10］.20 μL 体系:10×PCR Buffer 2 μL;dNTPs 0.2 mmol·L-1;引物浓度0.5 μmol·L-1;Taq 酶0.2 μL;模板150 ng;加水至20 μL.反应条件:94℃预变性2 min;94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，32 个循环;72℃10 min，4℃保存.产物经8 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测，于UVP 凝胶成像系统观察并拍照.

2 结果与分析

2.1 子房注射转化情况

本试验共注射金钗石斛子房35 个，得到成熟果荚10 个.授粉后10、20 和30 d 进行注射的果实均败育，未得到成熟果实.授粉后40、45、50 和60 d 获得的果实数分别为2、2、3 和3 个.

2.2 种子GUS 组织化学染色

对种子GUS 染色检测发现，40、45、50 和60 d 处理的果实注射部位的种子均有种子染上蓝色，而以45 d 处理的果实注射部位种子染色率最高，可达18%(表1，图1c、1d)，而40 、50 和60 d 处理的种子染色率相对较低.

表1 种子GUS 染色及原球茎潮霉素筛选结果Tab.1 The results of GUS assay of seeds and hygromycinresistance screening

图1 农杆菌子房注射法对金钗石斛的活体转化Fig.1 In planta transformation of Dendrobium nobile by ovary-injection of Agrobacterium

2.3 无菌播种

采用N16 固体培养基无菌播种培养，只对果皮消毒金钗石斛种子的污染率为0，种子的萌发率高，可达85%.对注射过工程农杆菌的果实仅对果皮进行消毒后，采用注射部位的种子培养时，100%的种子被污染.在对注射过工程农杆菌的果实经消毒后再对种子进行消毒后播种，仍有70%～80%的种子染菌，而对照的果荚同样处理染菌率仅为5%.

采用注射部位的种子在N16 固体培养基上培养，45 d 后形成原球茎，由于污染高，授粉后40、45、50 和60 d 的果实播种后分别只得到5、9、35、54 个原球茎，大部分萌发的原球茎因污染而死亡.

2.4 原球茎潮霉素筛选结果

将萌发获得的原球茎依次转入含30、40 和50 mg·L-1潮霉素的选择培养基上各培养15 d 进行抗性筛选，共计培养45 d 后，授粉后40 、45、50 和60 d获得的抗性原球茎数分别为3、5、8、7 个，除各取2个进行GUS 组织化学染色外，其余均转入无潮霉素的N16 培养基上培养，40 d 后能形成完整植株.

2.5 原球茎和幼苗的GUS 组织化学染色

对经过抗性筛选的原球茎切片进行GUS 染色，均可呈现蓝色，如图1 h.而4 个注射时期获得的原球茎各取2 个共8 个进行的GUS 检测结果全部为阳性.其余除4 个死亡外，11 个发育成11 株植株，随机取4 株经GUS 组织化学染色，整株各个部位均呈现蓝色，特别是幼叶和根部染色最深，说明这些部位代谢比较活跃(图1i).

2.6 转化植株分子检测

随机挑选4 株经潮霉素筛选之后生长良好的植株，提取基因组，进行PCR 检测，抗性植株均可获得与阳性对照相同的条带，而对照植株没有该条带(图1j).抗性植株扩增出目的条带说明外源基因已经整合到植株基因组内.

3 讨论与结论

目前，兰科植物转化体系通常采用农杆菌介导法和基因枪方法，这2 种方法操作复杂，而且转化效率较低，仅在石斛Dendrobium、蝴蝶兰Phalaenopsis、文心兰Oncidium 等少数几个属的物种中有成功报道，但是在相关报道中转化效率普遍较低［13-20］.农杆菌子房注射法和在拟南芥转基因中常用的in planta方法原理相同，结合了子房注射法和农杆菌介导法的优点，具有操作简单、不需要复杂的实验技术即能获得转化植物的特点［21-23］，但彭珍子等［23］报道，棉花一般在24 d 内完成受精，授粉之后24 h 时处理达到最高的转化效率.在用农杆菌进行活体转化时，要考虑农杆菌进入子房内部的时间，即生殖细胞处于较高的感受态，也要考虑农杆菌能进入胚囊中且不对受精作用产生影响.

兰花的种子无胚乳，自然条件下萌发率很低，种苗生产常采用无菌播种，而兰科植物相对于其他植物的最大优点在于兰科植物种子数量巨大，一般一个果荚中种子数量在数万至数十万个以上，应用农杆菌子房注射法进行活体遗传转化时，即使转化效率较低，也能获得较多的转化植株.但兰科植物从授粉到受精过程一般需要几十天，因此该种方法的转化效率对处理时间比较敏感.由于金钗石斛从授粉至受精的时间现在还没有确定，本试验选用了较大的时间跨度(10～60 d)进行子房注射.在授粉后10～30 d 注射时不能得到发育良好的成熟果实的原因可能是授粉后子房发育初期生存力较弱，需要一个较稳定的环境生长，此时进行子房注射易对果实发育造成较大伤害，最后导致果实败育脱落，而过了这段较敏感的时期，对子房进行注射能得到成熟果实.试验中在授粉之后45 d 时达到最高的转化效率，可能是因为此时大、小孢子发育成熟，即将发生或已经发生精卵融合，合子处于较高的感受态，容易接受外来遗传物质.

农杆菌子房注射法所得到的兰花种子无菌播种时需要采用双重消毒处理，若种子消毒不彻底，后期污染率较高，难以获得原球茎;若消毒方式太过强烈，有可能伤害种子并导致种子萌发率降低.本试验中，由于对消毒方法未进行系统的研究，获得无菌的抗性植株的比例较低.以后的试验中，需在播种培养基中加上广谱抗生素，频繁更换培养基等方法来控制污染，以提高种子的萌发率.

据相关报道，兰花受精过程发生在授粉之后30～70 d［24］，而本试验45 d 的处理取得了最高的转化效率，说明子房注射农杆菌法的原理和花粉管通道转化法在原理上有一致性，即主要是在受精前后，生殖细胞或者受精卵没有细胞壁或者细胞壁比较薄弱，处于较为敏感的感受态，较容易被转化.处理时间较早容易导致胚珠发育败育，而处理时间较晚，胚珠珠孔已经闭合，外源物质很难进入到胚珠内部.

另外，通过对抗性植株的PCR 检测，结果均呈阳性，说明外源基因已经整合到基因组内，证明农杆菌子房注射法能应用于兰科植物转基因育种中，至于是否能稳定遗传尚需进一步验证.

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