国产酮咯酸氨丁三醇分散片的人体相对生物利用度研究

张 鹏，廉江平，方志远，李小川

酮咯酸氨丁三醇为非甾体抗炎镇痛药，属于吡咯烷羧酸衍生物。本品经口服或注射被人体吸收后转化成酮咯酸发挥其抗炎镇痛作用，因其具有抑制花生四烯酸或胶原诱发的血小板聚集作用，故与其他非甾体抗炎药物的作用机制类似。酮咯酸氨丁三醇的镇痛活性较强，能有效缓解各类软组织、肌肉以及关节的中度疼痛。因其兼具迅速强效、非成瘾、非麻醉性等优势，故在临床上应用广泛［1-2］。国内外目前对酮咯酸氨丁三醇的注射剂、普通片剂、胶囊剂、滴眼剂等应用研究较多，但酮咯酸氨丁三醇分散片作为一种新剂型，具有较其他口服制剂吸收迅速、快速起效，较注射剂使用方便、快捷的特点。目前国内还没有对酮咯酸氨丁三醇分散片进行生物等效性评价的研究［3］。本研究建立了RP-HPLC法测定人血浆中酮咯酸氨丁三醇的浓度，通过比较健康志愿者分别口服分散片与胶囊剂后的药代动力学特点，评价两者的生物等效性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪(包括2010A自动进样器，SPD-M10Avp二极管阵列检测器，LCsolution色谱工作站，岛津公司);AS3120A超声震荡器(奥特赛恩斯公司);TEX-6涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂);IDL-5-A冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 药品与试剂 酮咯酸氨丁三醇分散片(受试制剂，10 mg/片，批号:070601);酮咯酸氨丁三醇胶囊(参比制剂，10 mg/粒，批号:070601);酮咯酸氨丁三醇对照品(纯度99.8%，批号:061101)均由山东新时代药业有限公司提供;空白人血浆(西安市中心血站);甲醇(色谱纯，TEDIA公司)，硫酸、氢氧化钠、磷酸、磷酸二氢钾、正己烷、乙醚等均为分析纯，蒸馏水为双蒸水。

2 方法

2.1 受试对象 临床试验方案经过我院伦理委员会审查批准。选择健康成年男性志愿者进行全面的体格检查，对肝、肾功能项目进行化验，并进行心电图、血压等检查。18名志愿者年龄为(22.1±1.5)岁，身高为(173.3±3.2)cm，体重(66.2±5.8)kg，在标准体重的±10%之内，体检结果正常，无药物过敏史及既往病史，精神状态良好。受试者在试验前签署知情同意书，并在试验前2周内未服用其他药物。受试期间禁烟、酒、茶，清淡饮食，并限制其进行剧烈活动。

2.2 试验设计与血样采集 采用双周期、自身交叉单次服药的对照试验设计。随机将18例受试者分为人数相等的两组。在试验前一日晚入院禁食12 h后，于翌日清晨8∶00空腹用220 mL温开水送服参比制剂或受试制剂20 mg，服药后2 h方可饮水，在服药后4 h和10 h进统一的低脂标准餐。医师负责对受试者进行临床监护，药学专业人员控制采血时间，护士负责采血工作。受试者分别于服药前和服药后 0.17、0.33、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0 h 采上肢静脉血4 mL，加入到肝素抗凝的离心管中，室温条件下静置15 min后，冷冻离心机3 000 r/min离心10 min，倾出上层血浆，保存于-20℃冰箱中用于日后测定。经过间隔7 d的清洗期后，两组受试者交叉服用与上一周期不同的酮咯酸氨丁三醇制剂，并严格按照上述试验设计的规定服药及采血。

2.3 血药浓度测定

2.3.1 血浆样品的处理 待测血浆室温融化，静置10 min后，取具塞试管，加入血样0.5 mL及0.6 mol/L硫酸溶液 200 μL，涡旋混匀;加入4.0 mL乙醚，涡旋振荡，充分提取后，于4 500 r/min离心5 min，吸取上层2.5 mL有机层置尖底离心管中，于40℃恒温水浴条件下氮气吹干，吸取2 mL正己烷充分溶解管中残留物，并精密加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液200 μL振荡混合，于4 500 r/min离心5 min，分取水层，精密加入0.6 mol/L硫酸溶液50 μL，充分混匀，滤膜过滤后，取50 μL进样测定。

2.3.2 色谱条件 色谱柱为Hypersil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，Thermo Quest公司)，流动相为0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(pH=2.5)-甲醇(55∶45);流速:1.0 mL/min;检测波长为321 nm。柱温:室温。

2.3.3 方法的专属性 按照“2.3.2”项下色谱条件，受试者的空白血浆样品、标准品及用药后的血浆色谱图见图1。酮咯酸氨丁三醇的保留时间约为10.1 min，空白血浆中的内源性物质对酮咯酸氨丁三醇的测定无干扰。

图1 HPLC法测定血浆中酮咯酸氨丁三醇的色谱图

2.3.4 标准曲线与线性范围 取空白血浆1.0 mL，加酮咯酸氨丁三醇标准系列溶液50 μL，配制成质量浓度为 49.50、99.00、247.50、495.00、990.00、1 980.00和3 960.00 ng/mL的血浆系列标准溶液，按“2.3.2”项下操作，进样 50 μL，记录色谱图。以药物质量浓度(C)为纵坐标、色谱峰面积(A)为横坐标进行回归计算，求得标准曲线方程为:C=0.005 9 A+5.29(n=7)，r=0.999 9，表明酮咯酸氨丁三醇血浆浓度在 49.50～3 960.00 ng/mL范围内线性关系良好，最低检测浓度为49.50 ng/mL。

2.3.5 方法回收率和精密度 取空白血浆1.0 mL，按“2.3.4”项下方法配制酮咯酸氨丁三醇低、中、高3个质量浓度(分别为 49.50、495.00、1 980.00 ng/mL)的血浆质控样品(n=5)，连续测定5 d，每日做一条随行标准曲线，记录色谱图，将色谱峰面积代入到当日随行标准曲线中计算血浆质控样品的测得浓度，与配制浓度进行比较，计算该方法的日间和日内精密度，数据见表1。

2.3.6 绝对回收率 取空白血浆1.0 mL，加入适量酮咯酸氨丁三醇标准溶液使血浆质量浓度分别为 99.00、495.00、1 980.00 ng/mL，按血浆样品的处理及血药浓度测定方法进行测定，另取酮咯酸氨丁三醇标准溶液，不经提取过程直接进样，以其所得色谱峰面积作为标准。前述3种不同质量浓度的血浆样品测定所得色谱峰面积结果与标准相比为绝对回收率。结果见表1。

表1 三种不同质量浓度的血浆样品的绝对回收率

2.3.7 稳定性试验 取空白血浆1.0 mL，按“2.3.3”项下方法制备质量浓度为495.00 ng/mL的酮咯酸氨丁三醇血浆质控样品，考察质控样品在室温放置24 h、-20℃条件下冻融循环3次、-20℃条件下冷冻15 d，以及血浆质控样品中的酮咯酸氨丁三醇提取溶液在室温条件下24 h内的稳定性。在4种稳定性考察条件下，其RSD值分别为3.35%、3.85%、3.67%、3.45%，说明酮咯酸氨丁三醇血浆样品在上述条件下稳定性良好。

2.3.8 药代动力学参数计算 数据结果由中国药科大学编制的药代动力学软件BAPP 2.0计算生成，Tmax和Cmax采用实测值，采用半对数作图法，由消除相末端的浓度点即直线斜率计算t1/2，计算主要药代动力学参数，使用梯形法计算药-时曲线下面积AUC值，求出受试制剂相对生物利用度F。

3 结果

3.1 药代动力学数据 18例受试者分别口服酮咯酸氨丁三醇分散片和胶囊后平均药-时曲线见图1，主要药动学参数见表2。

图2 受试者分别口服分散片和胶囊后平均血药浓度-时间曲线

表2 口服分散片和胶囊后受试者血浆中酮咯酸氨丁三醇药动学参数(±s，n=18)

表2 口服分散片和胶囊后受试者血浆中酮咯酸氨丁三醇药动学参数(±s，n=18)

注:两组比较，P＞0.05

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3.2 生物等效性评价 表2中的Tmax经非参数秩和检验，Cmax和AUC(0→24)经对数转换后进行方差分析，采用双单侧t检验和(1-2α)置信区间法进行生物等效性评价。对酮咯酸氨丁三醇分散片和胶囊的Tmax采用非参数法进行评价，结果表明，两制剂Tmax差异有统计学意义(P＜0.05)。Cmax的90%置信区间为参比制剂的93.61%～103.13%，在70%～143%范围内;受试制剂中酮咯酸氨丁三醇 AUC(0→24)的 90%置信区间为参比制剂的92.52% ～102.01%，在80% ～125%范围内，表明两种制剂的Cmax、AUC(0→24)拒绝生物不等效假设，受试制剂与参比制剂差异无统计学意义，受试制剂酮咯酸氨丁三醇分散片的相对于参比制剂酮咯酸氨丁三醇胶囊的生物利用度为97.86%±11.62%，两种制剂的 Cmax、AUC(0→24)拒绝生物不等效假设，酮咯酸氨丁三醇分散片剂与胶囊剂具有生物等效性。

4 讨论

有研究采用RP-HPLC法测定血浆中酮咯酸氨丁三醇浓度，优化了血浆样品处理方法，提高了方法灵敏度，减少了样品内源性干扰，方法重现性好，专一性强，可满足酮咯酸氨丁三醇药物动力学及生物利用度研究要求［4-5］。酮咯酸氨丁三醇被人体吸收后，转化为弱酸盐酮咯酸，有较好的水溶性。如果采用直接沉淀蛋白进样测定，虽然方法简便，但是血浆中的酮咯酸与杂质无法有效分离，且在低浓度范围监测灵敏度达不到准确定量要求。若直接采用有机溶剂也无法充分提取样品中的酮咯酸盐，可在样品中加入0.6 mol/L硫酸溶液使其解离度降低，提高提取效率;最后精密加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液从正己烷中反萃出酮咯酸，不但去除样品中脂溶性杂质，还使酮咯酸的浓度进行了富集，较直接沉淀法提高了检测灵敏度。

流动相选用磷酸二氢钾缓冲溶液(pH=2.5)-甲醇的原因是由于在该体系下，酮咯酸色谱峰峰形对称性较甲醇-水体系更佳、理论塔板数更高。另外，磷酸二氢钾可作为酮咯酸分子离解抑制剂，通过调节流动相的pH值，促使其在流动相中以酮咯酸分子的形式存在，抑制离解，增强其在色谱柱上的保留，同时减少峰的拖尾，并显著提高分离效果。

酮咯酸氨丁三醇分散片剂口服后较胶囊剂吸收更快，血药浓度在约0.68 h即达峰浓度，而胶囊剂则要在0.8 h左右达峰，故分散片剂较胶囊剂镇痛起效更快;考虑药物制剂体外溶出的各种影响因素，说明体内吸收差异主要是两种剂型的生产工艺差异造成的。

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［1］陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学［M］.第17版，北京:人民卫生出版社，2010:203.

［2］张志杰.新型非甾体止痛药—酮咯酸氨丁三醇(尼松)［J］.中南药学，2008，6(3):372-374.

［3］徐帆，余昉，尚北城，等.高效液相色谱法测定人体血浆中酮咯酸含量及其药动学［J］.中国医院药学杂志，2007，27(5):635-637.

［4］Olkkola KT.The pharmacokinetics of postoperative intravenous Ketorolac Trometha mine in children［J］.British Journal of Clinical Pharmacology，1991，31(2):182-184.

［5］马铭研，于治国.酮咯酸氨丁三醇在家兔体内药代动力学［J］.药物分析杂志，2008，28(1):54-57.