酮咯酸氨丁三醇抑制核转录因子对骨关节炎大鼠软骨损伤修复及血管新生的调节作用

江 涛，冯程程，张明月，余天美，张 天

膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是临床常见的退行性关节病，以膝关节软骨退变为主要特征，严重者会出现畸形及活动受限等症状，给患者的正常生活及工作造成巨大影响[1]。抗炎及镇痛药物是治疗KOA最常用的方式，但这种治疗只能减轻患者的疼痛程度，并不能阻止或减缓疾病的进展程度[2]。目前，临床治疗KOA的方式很多，以保守治疗为主，常用药物治疗，而药物又以非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)为首选[3]。透明质酸、类固醇等也是临床治疗KOA的常用药物，可有效缓解疼痛，但是易引发关节感染、关节软骨机械损伤等不良事件，疗效有限[4]。酮咯酸氨丁三醇是一种新型NSAIDs，既往研究证实其对KOA的镇痛效果显著，且具有较高的安全性，但其能否发挥修复KOA患者软骨损伤及调节血管新生的作用尚不得而知[5]。基于此，本研究建立KOA大鼠模型后，分别予以不同剂量酮咯酸氨丁三醇干预，通过对比分析酮咯酸氨丁三醇对KOA大鼠软骨损伤修复及血管新生的调节作用，并探讨相应的机制，旨在为酮咯酸氨丁三醇治疗KOA提供理论参考。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：健康雄性SD大鼠60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2017-0022。

1.1.2实验试剂与仪器：酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司)，氨基葡萄糖(浙江海正药业股份有限公司)，DEME细胞培养基(美国ScienCell公司)，胰蛋白酶、10%胎牛血清(美国Life Technology公司)，Western blot检测一抗(美国SANTA CRUZ公司)，辣根过氧化物酶结合的二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。恒温细胞培养箱(美国Thermo公司)，自动细胞计数仪、蛋白电泳及转膜仪(美国Bio-Rad公司)，倒置荧光显微镜(德国Leica公司)。

1.2KOA大鼠模型建造 将所有大鼠置于实验室环境适应性喂养后，取10只作为对照组，予以正常喂养，剩余50只大鼠根据文献[6]的方法建立KOA模型，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，双膝关节刮毛消毒后于膝关节内侧作2 cm的纵形切口，打开关节腔。将髌骨向外侧推至脱位，使膝关节处于最大屈曲状态，暴露关节腔后切断右膝前交叉韧带、内侧副韧带及内侧半月板，避免人为损伤关节软骨面，行抽屉试验阳性后彻底止血，逐层缝合。术后连续3 d肌肉注射青霉素预防感染，剂量为4×104U/d，第4天起每天驱赶动物奔跑30 min，其余时间自由活动。

1.3大鼠分组与给药 造模4周后将KOA模型大鼠随机分为模型组、氨基葡萄糖组、酮咯酸氨丁三醇0.5、1、2 mg/kg组，每组10只，10只未造模的大鼠为对照组。氨基葡萄糖组予以0.098 g/kg氨基葡萄糖灌胃，1/d；酮咯酸氨丁三醇0.5、1、2 mg/kg组分别予以0.5、1、2 mg/kg酮咯酸氨丁三醇灌胃，1/d；模型组及对照组均予以等体积生理盐水灌胃，1/d。所有大鼠均连续给药14 d。

1.4样本采集 给药结束后，取大鼠主动脉血1～2 ml，经离心分离血清。随后断颈处死大鼠，分离膝关节软骨组织及滑膜组织，置于液氮中保存备用。

1.5观察指标

1.5.1组织病理学分析：取各组膝关节软骨组织，采用多聚甲醛固定后制作厚度为4 μm的组织切片，进行番红O快绿染色，风干后采用光学显微镜观察软骨组织形态并拍照。

1.5.2血清学指标检测：采用ELISA法检测各组大鼠血清白介素-17(interleukin-17, IL-17)、IL-23、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)的含量。

1.5.3血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA检测：收集各组血清、软骨组织及滑膜组织，采用RT-PCR法分别检测各组血清、软骨组织及滑膜组织VEGF mRNA表达情况。采用Trizol试剂提取总RNA，然后用Fermentas公司生产的两步法RNA提取试剂盒将RNA转录成cDNA。选择VEGF的上下游引物，以cDNA为模板，采用PCR方法扩增待检测基因。基因产物通过2%琼脂糖凝胶检测，以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各组血清、软骨组织及滑膜组织中VEGF mRNA相对表达量。

1.5.4Western blot法检测蛋白表达情况：收集各组软骨组织，提取总蛋白，样品蛋白通过Bradford法于分光光度计检测其浓度。每样品孔上样40 μg总蛋白，进行SDS-PAGE分析。半干法将蛋白转至PVDF膜上，脱脂奶粉(50 g/L)室温封闭2 h，分别加入Survivin、VEGF、蛋白聚糖(Aggrecan)、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13, MMP-13)、Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen, Col Ⅱ)、核转录因子(nuclear factor-κB, NF-κB)、IκB-α和IκB-β一抗，4℃过夜，用TBST洗膜10 min，共5次，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h，用TBST洗膜10 min，共5次，ECL显影剂显影，采用Image J软件进行灰度分析。计算Survivin、VEGF、Aggrecan、MMP-13、Col Ⅱ、NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白相对表达量。

2 结果

2.1软骨组织的病理改变及Survivin蛋白表达 番红O快绿染色图片显示，对照组软骨组织关节面光滑，无Aggrecan丢失，保持正常关节软骨结构；模型组软骨组织透明软骨层变薄且呈现纤维化，关节软骨面大量Aggrecan丢失、出现软骨退变，部分甚至出现软骨剥脱。与模型组比较，氨基葡萄糖组软骨组织Aggrecan量明显增加，关节软骨结构基本保持正常。不同浓度酮咯酸氨丁三醇组，随着酮咯酸氨丁三醇浓度增加，大鼠软骨组织Aggrecan量逐渐增加，关节软骨结构也逐渐恢复正常。见图1。与对照组比较，模型组软骨组织Survivin蛋白表达量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，氨基葡萄糖组、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg组软骨组织Survivin蛋白表达量明显升高(P<0.05)。与氨基葡萄糖组比较，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg组软骨组织Survivin蛋白表达量明显降低(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组与氨基葡萄糖组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 6组大鼠软骨组织病理改变(番红O快绿染色 ×200)

A.对照组；B.模型组；C.氨基葡萄糖组；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg组；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg组；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组

图2 6组大鼠软骨组织Survivin蛋白印迹图和相对表达量

A.对照组；B.模型组；C.氨基葡萄糖组；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg组；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg组；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组；KOA为膝骨关节炎；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与氨基葡萄糖组比较，eP<0.05

2.2软骨标记蛋白表达情况 与对照组比较，模型组软骨组织Aggrecan及Col Ⅱ蛋白相对表达量明显降低，而MMP-13蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。与模型组比较，氨基葡萄糖组、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg组软骨组织Aggrecan及Col Ⅱ蛋白相对表达量明显升高，而MMP-13蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。与氨基葡萄糖组比较，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg组软骨组织Aggrecan及Col Ⅱ蛋白相对表达量明显降低，而MMP-13蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组Aggrecan、Col Ⅱ、MMP-13蛋白相对表达量与氨基葡萄糖组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 6组大鼠软骨组织Aggrecan、MMP-13、Col Ⅱ蛋白印迹图和相对表达量

A.对照组；B.模型组；C.氨基葡萄糖组；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg组；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg组；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组；KOA为膝骨关节炎，MMP-13为基质金属蛋白酶-13、Col Ⅱ为Ⅱ型胶原蛋白；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与氨基葡萄糖组比较，eP<0.05

2.3血清、软骨及滑膜组织VEGF mRNA和蛋白表达量 与对照组比较，模型组血清、软骨及滑膜组织VEGF mRNA和蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。与模型组比较，氨基葡萄糖组、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg组血清、软骨及滑膜组织VEGF mRNA和蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。与氨基葡萄糖组比较，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg组血清、软骨及滑膜组织VEGF mRNA和蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组血清、软骨及滑膜组织VEGF mRNA和蛋白相对表达量与氨基葡萄糖组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.4血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平 与对照组比较，模型组血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平均明显升高(P<0.05)。与模型组比较，氨基葡萄糖组、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg组血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平均明显降低(P<0.05)。与氨基葡萄糖组比较，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg组血清IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平均明显升高(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1水平与氨基葡萄糖组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

2.5软骨组织NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白表达情况 与对照组比较，模型组软骨组织NF-κB蛋白相对表达量明显升高，而IκB-α和IκB-β蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。与模型组比较，氨基葡萄糖组、酮咯酸氨丁三醇1、2 mg/kg组软骨组织NF-κB蛋白相对表达量明显降低，而IκB-α和IκB-β蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。与氨基葡萄糖组比较，酮咯酸氨丁三醇0.5、1 mg/kg组软骨组织NF-κB蛋白相对表达量明显升高，而IκB-α和IκB-β蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组软骨组织NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白相对表达量与氨基葡萄糖组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。

图4 6组大鼠血清、软骨及滑膜组织VEGF mRNA和蛋白相对表达量

A.对照组；B.模型组；C.氨基葡萄糖组；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg组；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg组；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组；VEGF为血管内皮生长因子；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与氨基葡萄糖组比较，eP<0.05

图5 6组大鼠血清IL-17、IL-23、iNOS及MCP-1水平比较

A.对照组；B.模型组；C.氨基葡萄糖组；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg组；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg组；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组；IL-17为白介素-17，IL-23为白介素-23，iNOS为诱导型一氧化氮合酶，MCP-1为单核细胞趋化蛋白-1；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与氨基葡萄糖组比较，eP<0.05

图6 6组大鼠软骨组织NF-κB、IκB-α和IκB-β蛋白印迹图和相对表达量

A.对照组；B.模型组；C.氨基葡萄糖组；D.酮咯酸氨丁三醇0.5 mg/kg组；E.酮咯酸氨丁三醇1 mg/kg组；F.酮咯酸氨丁三醇2 mg/kg组；KOA为膝骨关节炎，NF-κB为核转录因子；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与氨基葡萄糖组比较，eP<0.05

3 讨论

既往研究证实，KOA的根本原因在于关节软骨本身的病变，由于机械性的外伤或炎症等因素造成的软骨损伤，导致软骨成分暴露，进而引发自身的免疫反应，造成继发性损伤[1]。因此，临床治疗KOA的关键在于保护软骨组织并促进其修复[7]。透明质酸、类固醇等是临床常用药物，虽能改善KOA患者关节疼痛，但长期使用会加重软骨损伤[8-9]。相比较而言，氨基葡萄糖治疗KOA不仅可明显减轻痛感，还能延缓及改变KOA的病理进程，发挥对软骨组织的保护作用，全面恢复受损关节的功能[10-11]。基于此，本研究以氨基葡萄糖为阳性对照，探究酮咯酸氨丁三醇在KOA治疗中的应用价值。本研究结果显示，与对照组比较，模型组软骨组织出现退变，部分甚至出现软骨剥脱，说明KOA会造成软骨组织损伤，与Hillen等[12]研究结果一致。在予以KOA大鼠氨基葡萄糖干预后，软骨损伤得到明显改善，而随着酮咯酸氨丁三醇给药浓度的升高，大鼠软骨损伤的改善作用与氨基葡萄糖组效果相当，提示酮咯酸氨丁三醇也可有效促进软骨损伤的恢复。软骨细胞凋亡被认为不同于经典的细胞凋亡，是变异的凋亡，而细胞凋亡是KOA软骨损伤的关键过程。Survivin蛋白具有抑制细胞凋亡的作用，被证实在KOA关节局部及血清中均显著表达，在KOA的发病中起着关键作用，而酮咯酸氨丁三醇干预可明显提升软骨组织Survivin蛋白表达量，进而抑制细胞凋亡的发生，而这可能是酮咯酸氨丁三醇发挥软骨组织保护作用的机制之一[13]。

细胞外基质主要是由Aggrecan及Col Ⅱ组成，Col Ⅱ分布于软骨组织中发挥着吸收及分散压力的作用，Aggrecan覆盖于胶原纤维的表面，对胶原纤维骨架起着很好的保护作用，二者共同维持软骨的生物力学功能[14]。MMP-13在软骨细胞外基质，尤其是在Aggrecan及Col Ⅱ的裂解过程中起着至关重要的作用，可直接裂解Col Ⅱ，破坏软骨骨架[15-16]。此外，iNOS对Aggrecan有高度的裂解性，在关节软骨机制降解中起着非常重要的作用，还可激活其他细胞因子如MMP-13破坏软骨[17]。本研究结果显示，KOA大鼠软骨组织Aggrecan及Col Ⅱ表达量明显降低，而MMP-13表达量及血清iNOS水平显著上升，进一步证实KOA可造成软骨组织损伤。而酮咯酸氨丁三醇干预治疗可明显抑制上述过程，在高浓度下其改善作用与氨基葡萄糖相当，证实酮咯酸氨丁三醇能通过抑制MMP-13的表达及血清iNOS水平，防止软骨组织中Aggrecan及Col Ⅱ的裂解，进而维持软骨的生物力学功能，促进其损伤修复。

MCP-1是一种常见的趋化因子，主要由滑膜的成纤维细胞在炎性细胞因子的诱导下合成。在KOA病变关节处可产生大量MCP-1，可趋化单核巨噬细胞及淋巴细胞进入关节滑膜组织；另一方面，浸润于滑膜组织的细胞在激活状态下又可分泌多种包含MCP-1在内的趋化因子，他们之间相互作用进一步增加炎症细胞在关节滑膜组织中的浸润及炎性细胞因子的过度产生，从而使炎症反应反复发生，这也是KOA的发病机制之一[18]。而酮咯酸氨丁三醇能明显降低KOA大鼠血清MCP-1及炎性因子IL-17、IL-23的水平，提示酮咯酸氨丁三醇治疗KOA能通过降低MCP-1水平来抑制炎性因子的释放，进而改善关节炎症状态，而这一结果在宋雪等[5]研究中也得到证实。

VEGF是血管内皮细胞分泌的促进新生血管形成的特异性因子。本研究结果发现，KOA大鼠血清、软骨及滑膜组织中VEGF mRNA和蛋白的表达量均明显上升，VEGF可特异性地与滑膜成纤维样细胞结合，促进滑膜细胞的有丝分裂[19]。此外，VEGF与滑膜内血管内皮细胞结合，不仅可促进血管的生成，还能提升血管通透性，促进金属蛋白酶及间质胶原酶的分泌，直接参与软骨及骨的破坏过程[20]。酮咯酸氨丁三醇可明显抑制血清、软骨及滑膜组织中VEGF mRNA和蛋白的表达，证实酮咯酸氨丁三醇可通过抑制血清、软骨及滑膜组织中VEGF水平抑制血管新生，进而防止关节损伤的进一步发展。

NF-κB广泛存在于哺乳动物细胞中，可调控靶基因如生长因子、细胞因子等表达，进而介导炎症及血管新生过程[21]。NF-κB的激活因素及其效应基因均广泛分布，众多的促血管生成因素，如缺氧、IL-17、IL-23等是NF-κB的刺激因素。活化的NF-κB介导产生促血管生成因子，如VEGF、IL-17、IL-23等，进而通过直接及间接的多种途径，强烈促进血管新生[22]。本研究结果发现，酮咯酸氨丁三醇可有效抑制NF-κB的产生，实现对IL-17、IL-23、iNOS、MCP-1等炎性因子表达的抑制作用，进而改善关节炎症状态，抑制血管新生，促进关节恢复。

综上所述，酮咯酸氨丁三醇可通过抑制NF-κB表达水平抑制KOA大鼠血管新生，改善关节炎症状态，进而促进其软骨损伤修复。