VEGF和MVD在下咽鳞癌组织中的表达及其意义

甘卫刚，洪育明，刘 海，梁振源

(1.川北医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，四川南充 637000;2.福建医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科，福建泉州362000)

下咽癌作为头颈部发病率较低的恶性肿瘤，原发于下咽黏膜上皮，以鳞状细胞癌为主，具有生长部位隐蔽，各种临床症状有出现相对较晚、生长侵袭、转移率较高等特性，临床诊断较难，发现较晚，晚期生存率低，生活质量差。因而，研究细胞因子与下咽鳞癌血管发生、肿瘤生长的相关性，观察下咽鳞癌预后的相关指标，不仅为下咽鳞癌的早期诊断提供合理的理论依据，也将在一定程度上为综合治疗提供指导。

近年来，研究［1-2］表明:CD105在多数实体肿瘤中如胃癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌等异常表达，与肿瘤发生、发展及预后关系密切。另有研究［3-4］表明，VEGF及CD105标记的MVD在头颈部恶性肿瘤，如舌鳞癌、喉鳞癌、食管鳞癌等中异常表达，提示其与头颈部恶性肿瘤的生物学行为具有密切关系。本研究采用免疫组化PV-9000二步法，检测下咽鳞状细胞癌和正常下咽黏膜中VEGF、CD105标记的MVD的表达，旨在分析它们与下咽鳞癌发生、发展、分型、分期、淋巴结转移及预后的相互关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 实验组 选择我院及合作医院下咽鳞状细胞癌手术切除标本50例(术前均未经放化疗)，标本采集时间起自2000年1月至2012年8月，其中男性47例，女性3例;年龄42～79岁，平均年龄56.8岁;按肿瘤原发部位可分为:梨状窝区26例，下咽后壁区15例，环后区9例;临床分期参照国际抗癌协会(UICC，2002)TNM分期标准:T1～T220例(其中T14例;T216例);T3～T430例(其中，T322例;T48例);肿瘤组织学分化程度:低分化癌9例、中分化癌26例、高分化癌15例;颈部淋巴结转移情况:颈淋巴结转移阴性者7例，颈淋巴结转移阳性者43例。

1.1.2 对照组 选取下咽癌手术癌旁组织(距肿瘤切缘2～3 cm)，以及喉癌患者行全喉切除术的环后区或梨状窝区黏膜，切取标本均为肉眼观正常，并在HE染色镜下确认未见癌细胞的下咽正常黏膜组织50例。

1.2 主要试剂

①兔抗人单克隆抗体 VEGF(浓缩型，ZA-0509);②鼠抗人单克隆抗体 CD105(即用型，ZM-0297);③PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒等。以上试剂为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.3 实验方法

按照免疫组化二步法(PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒说明书提示步骤)进行免疫组化染色，VEGF、CD105标记的MVD均用已知血管肉瘤组织作阳性对照，二者均用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 染色结果判断

VEGF的阳性表达为细胞质呈棕黄色，根据阳性表达的细胞数和阳性表达部位的染色强度两种标准进行综合评分:①以着色细胞占视野细胞总数的多少进行评分，0分:0;l分:≤25%;2分:26% ～49%;3分:≥50%。②按表达部位染色强度评分，0分:视野中细胞均无染色;1分:阳性表达部位染成浅棕色;2分:细胞阳性表达部位染成棕色且背景无着色，或细胞阳性表达部位染成深棕色并有浅棕色背景;3分:细胞阳性表达部位染成深棕色且背景无着色。分别按上述标准，在有经验的病理科诊断医生指导下采用双盲法进行评分，评分结果相乘为最终得分:记0分，评分为0分者;记1分，评分为1～2分者;记2分，评分为3～4分者;记3分，评分为6～9分者。阴性，记为0～1分者;阳性，记为2～3分者［5］。

CD105阳性表达主要在血管内皮细胞质呈棕黄色，微血管计数判断标准参照Weidner等［6］的评判标准，计算肿瘤着色的毛细血管和微小血管，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群，并与周围组织有明显界限者作为一个血管计数，先用低倍镜下(×40)选择5个MVD最高区，然后在400倍镜下计数，取5个视野的微血管数平均值作为MVD，结果以(±s)表示。

1.5 图像分析

先在OLYMPUS BX41光学显微镜下观察免疫组化切片表达情况，然后选择每张切片的4个角和中央共5个区域，在400倍视野下，采用 Motic MED6.0数码医学图像分析系统在同一个光源、亮度、色彩饱和度、增益、对比度及白平衡条件下进行拍照，所得图片应用美国Media Cybemetics公司生产的Image-ProPlus图像分析软件(Version6.0)(IPP 6.0)进行图像分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析:①VEGF在实验组与对照组之间阳性表达率比较采用Chisquare Test，MVD计数在两组间比较采用t检验;②VEGF图像分析结果及MVD计数均采用均数±标准差(±s)表示，两者与临床特征之间的关系采用t检验，3组之间的比较采用F检验;③VEGF、MVD计数相关性采用Pearson相关性分析。所有结果均有统计学意义(P＜0.05)。

2 结果

2.1 VEGF蛋白在下咽鳞癌及正常下咽黏膜中的表达情况

VEGF在下咽鳞癌组织及正常下咽黏膜中的表达均定位于细胞质，呈棕黄色颗粒(图1、2)。在50例下咽鳞癌中阳性表达者37例，表达率为74.00%(37/50)，而在50例正常下咽黏膜中阳性表达者15例，占 30.00%(15/50)，两组间比较 χ2=9.307，P=0.002＜0.05，差异具有统计学意义，表明VEGF在下咽鳞癌中的表达显著高于正常下咽黏膜。

2.2 下咽鳞癌组织中VEGF的表达与临床病理学指标的关系

下咽鳞癌组织中VEGF的表达与癌组织的临床分期、组织学分级及淋巴结转移与否密切相关，差异具有统计学意义，均P＜0.05。即下咽鳞癌组织的T分期越高、组织学分级程度越低或伴有淋巴结转移者，VEGF呈显著高表达;不同肿瘤原发部位、年龄、性别、吸烟史的患者，VEGF表达无统计学意义，均P＞0.05(表1)。

表1 VEGF蛋白在下咽鳞癌中的表达与临床病理特征的关系

2.3 MVD-CD105在下咽鳞癌及正常下咽黏膜中的表达情况

CD105蛋白表达阳性信号主要定位于血管内皮细胞细胞质，呈棕黄色粒状(图3-5)，利用CD105标记的MVD计数在下咽鳞癌组织中平均为(37.10±5.95)，而在正常下咽黏膜组织中MVD计数平均为(8.70±3.34)，两组间差异有的统计学意义，t=25.245，P=0.000＜0.05，表明下咽鳞癌组织中MVD计数明显高于正常下咽黏膜组织。

2.4 下咽鳞癌组织中MVD-CD105的表达与临床病理学指标的关系

MVD-CD105在下咽鳞癌组织中的表达与癌组织的临床分期、组织学分级及淋巴结转移与否密切相关，表达差异具有统计学意义，均P＜0.05。下咽鳞癌组织中，MVD计数在T3～T4组显著高于T1～T2组，高分化组显著低于中-低分化组，伴淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，均P＜0.05;不同年龄、性别、吸烟史及不同肿瘤原发部位的患者中MVD计数差异无统计学意义，P＞0.05(表2)。

表2 MVD-CD105在下咽鳞癌中的表达与临床病理特征的关系

2.5 VEGF和MVD表达在下咽鳞癌组织中的相互关系

采用Pearson相关性分析，对VEGF、MVD两者在下咽鳞癌组织中的表达进行统计学分析，得出:VEGF蛋白表达与MVD计数呈显著正相关，r=0.582，P=0.000 ＜0.05(表3)。

表3 下咽鳞癌组织中VEGF蛋白表达与MVD计数的相关性

3 讨论

3.1 VEGF在下咽鳞癌中表达的临床意义

1989年，Ferrara等［7］从牛脑垂体滤泡星形细胞体外培养液中分离并纯化一种蛋白质，命名为血管内皮生长因子。VEGF家族是特异性地作用于内皮细胞的生长因子(不光作用于血管内皮)，主要成员包 括:VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，和 VEGF-D。VEGF的受体属于酪氨酸激酶家族，主要包括三个成员:VEGF-R1(Flt-1)，R2(Fit-1/KDR)和 R3(Flt-4)。VEGF/VEGF-R2途径被认为参与诱导血管形成，而 VEGF-C/VEGF-R3或 VEGF-D/VEGF-R3途径则被认为参与诱导淋巴管形成。故VEGF-C和VEGF-D又被称为淋巴管生成因子［8］。VEGF使得血管内瘤细胞能够轻易穿透血管基底［6］。另外，VEGF可显著地延长血管内皮细胞的寿命，使血管内皮细胞的繁殖次数增加15～20次。

Petruzzelli 等［9］使用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对5种不同的头颈部肿瘤中VEGF的表达进行检测，结果显示均有VEGF的显著表达，并且在使用VEGF抗体处理的细胞株中观察到内皮细胞的增殖明显被抑制，表明VEGF与头颈部肿瘤组织的内皮细胞有丝分裂有关。

本实验研究发现VEGF在下咽鳞癌组织中的表达明显高于下咽正常黏膜，且具有统计学意义(P=0.004)。结果与国外学者分别利用原位杂交［10］、免疫组化方法［11］分析VEGF在头颈部恶性肿瘤中的表达情况得出的结论基本一致，这可能提示VEGF与下咽鳞状细胞癌的发生、发展密切相关。我们认为其可能机制为VEGF促进血管内皮细胞增殖，促进血管支持物的生成，增加血管通透性，为下咽鳞癌生长提供营养基础;同时，促进淋巴管增生，引起肿瘤淋巴转移，与其预后不良相关，其确切机制有待进一步研究。

Salven等［12］用免疫组化技术对头颈鳞癌患者的VEGF表达进行了研究，并进行了5年生存率随访，检测结果发现癌细胞质中VEGF显著表达;同时，血管内瘤细胞能够轻易穿透血管基底，促进淋巴转移。VEGF的高表达也在一些肿瘤渗入的炎性细胞(包括血细胞和组织巨噬细胞)中表现出来。

在本研究中，我们还采用图像分析系统对下咽鳞癌组织中的VEGF蛋白表达水平进行分析，发现VEGF表达在下咽鳞癌组织T3～T4组显著高于T1-T2组(t=-2.216，P=0.031 ＜0.05)，组织学高级分化组显著低于中-低分化组(t=-2.418，P=0.019＜0.05)，伴淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(t=-2.346，P=0.023＜0.05)。同类研究中，Dray等［13］利用免疫组化法对108例原发头颈肿瘤病人的VEGF表达进行了相关研究，研究发现VEGF在头颈鳞癌细胞中的表达经常被邻近组织及炎症细胞所介导，故VEGF的表达在头颈鳞癌中不作为一个判断预后的独立指标。

VEGF除了通过刺激内皮细胞生长，介导新生血管生成为下咽鳞癌生长提供营养和氧气外，更能够改变新生血管通透性，使得癌细胞能够穿过血管基底，进入血流，分布到邻近和远处组织，促进肿瘤生长浸润和远处转移。研究证实，VEGF还可诱导新生淋巴管形成，介导癌细胞进入淋巴循环，导致淋巴转移，在下咽鳞癌中常见为颈部淋巴转移。

3.2 MVD-CD105在下咽鳞癌中表达的临床意义

MVD是通过采用血管标记因子，如CD31、CD34、CD105、vWF及Ⅷ因子等检测肿瘤组织中新生血管的数量、形态及分布的指标，可以量化肿瘤组织中血管生长速度，反应肿瘤组织接受氧供和营养支持的程度，在较多研究中，学者们仍以CD34作为标记物，研究结果多可反应血管生成情况［14］。然而，近年来，CD105被发现是目前肿瘤组织中标记未成熟血管的最特异指标，更能精确地反应肿瘤微血管密度值。

Wikstrom 等［15］发现:CD105主要在未成熟的血管上表达。Saad等［16］研究证实，CD105比 CD34和vWF更好作为肿瘤血管标志物及预测肿瘤预后，CD105可作为一种标记新生血管生成的较理想的标志物。

另外，CD105可作为一氧化氮的调节因子，在小鼠股动脉中，CD105的表达水平调节内皮型一氧化氮合酶的数量。在培养的内皮细胞中，CD105表达的强弱相应导致内皮型一氧化氮合酶明显的上升或下降。因此，CD105与血管的发生、生成及血管壁完整性维护有关。因CD105受低氧条件和TGF-β1的共同作用诱导表达，而肿瘤组织，尤其是恶性肿瘤，在早期阶段生长迅速，需要充足的氧气和营养支持，而正常的血管发生和形成速度难以满足其需求，经上述调解模式，此时便出现CD105在活性血管生成区内皮细胞中高表达，这也就解释了为什么大血管及正常组织的血管内皮细胞中CD105呈表达显著下降或呈阴性表达［17］。

顾欣等［18］研究发现，CD105标记的MVD在喉鳞状细胞癌高分化组和低分化组的差别有显著意义，随肿瘤浸润范围的增大而增加，且随临床分期升高而增加。Schimming等［19］发现 CD105标记口腔鳞状细胞癌微血管密度值明显高于邻近的正常黏膜;并且与肿瘤的增殖、分期、转移显著相关。Akagi等［20］研究发现，在结、直肠腺瘤由轻度、重度不典型增生至腺癌发展的过程中，CD105标记的微血管密度值逐渐升高，提示CD105有助于早期诊断。

本研究进一步发现，CD105标记的MVD与下咽鳞状细胞癌患者的性别、年龄、吸烟史及肿瘤原发部位之间差异无统计学意义(均P＞0.05)。而MVD计数在下咽鳞癌组织T3～T4组显著高于T1～T2组，组织学高级分化组显著低于中-低分化组，伴淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，与 Chien等［21］学者对舌鳞癌组织的研究结果相一致，故可认为CD105标记的MVD与下咽鳞癌的发生、生长和转移密切相关，其检测结果有助于我们对下咽鳞癌的早期认识及对病情、预后等的综合判断。

肿瘤组织中的新生血管在形态学、数量变化和分布规律方面反应肿瘤的生物学行为变化，根据MVD表达与下咽鳞癌的临床进展一致，我们认为下咽鳞癌中微血管密度与病情发展程度密切相关，在一定意义上可以量化肿瘤新生血管，从而推测MVD可以作为下咽鳞状细胞癌病情评估的量化指标。CD105是目前肿瘤新生血管的良好标志物，主要表达于未成熟血管内皮细胞表面，可显示出单个内皮细胞和较小的微血管，即体现出肿瘤发生和初步形成阶段，肿瘤血管的数量变化。

本研究还发现，下咽鳞癌组织中，CD105标记的微血管分布主要呈现两种趋势，即在中-低分化组，微血管主要分布于癌组织间(图3A);而在高分化组中，微血管则可见分布于癌巢内，也可见分布于癌间质区(图3B)，这种分布紊乱可能在一定程度上利于肿瘤细胞迁徙入血管，加速肿瘤生长、增强侵袭潜能。对于组织学分化不同的下咽鳞癌组织中，微血管分布的差异性，未在此次实验中进行详细阐述，但可在以后的研究工作中，进一步观察导致上述现象出现的具体机制。

3.3 下咽鳞癌中VEGF表达及MVD计数的相互关系

VEGF在肿瘤血管形成中的重要作用已得到证实，MVD计数则为评估肿瘤血管生成提供客观依据，根据实验结果显示，VEGF与MVD-CD105在下咽鳞状细胞癌中的表达均显著升高，两者具有正相关性。这一结果提示VEGF蛋白的过度表达与肿瘤MVD计数升高密切相关，可以认为VEGF蛋白促进下咽鳞状细胞癌的新生血管生成，并促进下咽鳞状细胞癌组织的增殖与转移，与MVD计数的变化一致，并与不良预后密切相关。

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