二色补血草总黄酮的提取纯化及其对大鼠激素水平的影响

欧 莉 苗彦霞 卫培峰 王 杰

(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)

二色补血草是白花丹科补血草属的多年生草本植物，别名血见愁、苍蝇花 、蝇子草、燎眉蒿。主产于河北、河南、山西、内蒙古、陕西、甘肃等地〔1〕。全草入药，性味甘平，补血益气，止血散瘀。主治功能性子宫出血、宫颈癌、月经不调、肾盂肾炎、胃溃疡等症〔2〕。二色补血草以其确切的药用价值而备受人们关注，近几年来对此药材的开发利用也逐渐深入〔3，4〕，研究结果发现二色补血草主要含黄酮、鞣质、生物碱、没食子酸等物质，其乙醇提取物能明显缩短小鼠出、凝血时间〔5，6〕。本论文以二色补血草醇提液为原料，利用大孔树脂对其总黄酮进行纯化处理，并探讨其对去势大鼠血清雌二醇(E2)及孕酮(P)的影响，从而进一步揭示二色补血草总黄酮治疗功血的作用机制，以期为临床应用提供了一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 UV-1102紫外分光光度计，上海天美科技仪器公司;BS124S电子天平，德国塞多利斯有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器，上海亚荣仪器厂;DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 材料与试剂 二色补血草购自陕西眉县德尔康药材公司;芦丁标准品，中国药品生物制品检定所;D101树脂购自西安蓝深交换吸附材料有限公司;E2、P放免试剂盒由天津市协和医药科技有限公司提供，批号:201108;宫血宁胶囊:0.113 g/粒，由云南白药集团股份有限公司提供，批号:20110408。青霉素注射液，规格:160万U/ml，由哈药集团制药总厂提供，批号:A110810910。

1.3 方法

1.3.1 二色补血草总黄酮的提取与纯化

1.3.1.1 对照品溶液的制备 精确称取芦丁标准品100 mg，用60%乙醇溶解，定容于25 ml容量瓶中，即得芦丁对照液体，浓度为4 mg/ml。

1.3.1.2 标准曲线的绘制 采用硝酸铝比色法，在波长510 nm处测定吸光度。溶液的吸光度Y和黄酮的浓度X的关系为:Y=2.376 5X－0.020 8(线性质量范围为0.040 0～0.160 0 mg/ml，R2=0.999 5)，X 的单位为 mg/ml。

1.3.2 二色补血草总黄酮的提取 称取一定量的二色补血草，用10倍量的60%乙醇溶液，于50℃水浴中提取3 h，共回流提取2次〔7〕，过滤，减压浓缩至生药量0.24 g/ml，过滤得二色补血草醇提取液。

1.3.3 二色补血草总黄酮的纯化 采用D101树脂对二色补血草总黄酮进行纯化，静态吸附12 h后，先用水(3倍量)进行洗脱，去掉滤液。再用70%乙醇(5倍量)进行洗脱，旋转蒸发回收乙醇，合并滤液，按1.3.1.2测定其吸光度。

1.3.4 二色补血草总黄酮的含量测定 精密称定0.14 g(5 ml)二色补血草总黄酮提取物，溶于40 ml 60%乙醇溶液中，定容至 50 ml。取 1 ml，加水至 4 ml，加 5%NaNO20.4 ml，放置6 min，加 10%NaNO20.4 ml，放置 6 min，加 4.3%NaOH 4 ml，加水定容至10ml，摇匀后放置15min。在330nm波长处测定吸光度。根据标准曲线Y=2.376 5X－0.020 8(线性质量范围为0.040 0 ～0.160 0 mg/ml，R2=0.999 5)，计算二色补血草总黄酮含量。

1.3.5 二色补血草总黄酮对去势大鼠血清指标的影响

1.3.5.1 动物造模 取180～220 g雌性SD大鼠90只 ，适应性喂养7 d。行卵巢切除术而进行去势造模。术后用青霉素40万U·kg－1·d－1肌注，连用3 d，于术后第7天进行阴道脱落细胞涂片检查，并连续检查5 d，以阴道涂片不出现角化上皮细胞作为去势造模成功指标。

1.3.5.2 动物分组及指标测定 选取造模成功的大鼠60只，随机分为6组，每组10只，分别为二色补血草总黄酮低、中、高剂量组、二色补血草水煎液组、宫血宁对照组和模型对照组。每天灌胃给药1次，连续给药14 d，末次给药后进行眼眶取血，采用酶免试剂盒检测血清E2、P水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 二色补血草总黄酮的含量测定 二色补血草醇提液浓缩至生药量0.24 g/ml，纯化后浸膏中总黄酮含量为65.46%，即每克浸膏中含总黄酮0.065 46 g。

2.2 对去势大鼠血清E2与P的影响 行卵巢切除术制造对大鼠进行去势造模成功，其模型对照组的各项所测指标与假手术组组比较均有显著性差异(P＜0.01)。给药后，二色补血草总黄酮各剂量组和宫血宁组均可提高去势大鼠血清中E2和P的含量，其中二色补血草总黄酮高剂量组对模型大鼠血清中的E2水平具有明显的改善作用(P＜0.01)，且呈现一定的量效关系，阳性对照药宫血宁也可显著提高模型大鼠血清中的E2水平(P＜0.05)。见表1。

表1 二色补血草总黄酮对去势大鼠血清E2、P 的影响(n=10，x±s)

3 讨论

二色补血草中含有大量的化学成分，其中的黄酮类化合物因分子中具有酚羟基，故显酸性。一般黄酮苷元难溶于水，易于溶于乙醇，甲醇，乙醚，氯仿等有机溶剂中，因此选择乙醇作为溶剂提取黄酮，可有效提高原料的提取率。故本实验参照以往实验优化工艺，采取料液比为1∶15，浓度为60%的乙醇为提取剂，于50℃水浴中提取3 h，共回流提取2次，并采用D101树脂对二色补血草总黄酮进行纯化。

根据排卵与否，通常将功血分为无排卵型及排卵型两大类，前者最为多见，约占80% ～90%。由于卵巢功能衰退，卵泡数明显减少，且对促性腺激素敏感性降低，雌激素明显减少，促性腺激素水平升高，因达不到雌激素的正反馈水平而无排卵前LH峰形成，以致无排卵。由于卵巢不能有规律的排卵，孕激素缺乏，子宫内膜因在单一雌激素作用下而发生不同程度的增生。当雌激素水平突然下降或波动幅度较大时，则发生雌激素撤退性或突破性出血。本实验结果表明，二色补血草总黄酮可能通过雌激素样物质与孕激素样物质的共同协同作用而治疗功血，可避免由于功血患者体内雌激素过多，孕激素缺乏，导致雌激素突破性的出血情况发生。但二色补血草总黄酮是如何作用于子宫内膜靶器官，是否能促使功血患者子宫内膜的修复还需要做进一步的探索研究。

1 王振恒，张 继，哈 飞.等.二色补血草资源综合开发利用〔J〕.中华实用中西医杂志，2005;18(7):1076-8.

2 白 莹，符永鹏，王文英.等.二色补血草不同部位总黄酮类物质提取及抗氧化能力的研究〔J〕.光谱实验室，2009;26(3):467-9.

3 田福平，时永杰，陈子萱.我国补血草属野生植物资源的分布及研究现状〔J〕.草业与畜牧，2010;172(3):49-52.

4 许毅洪，李福生，赵洪涛.人工栽培二色补血草前景光明〔J〕.植物杂志，2004;1(1):12-3.

5 张 敏，唐旭利，李国强.滨海湿地耐盐植物二色补血草化学成分研究〔J〕.中国海洋大学学报，2010;5(5):89-92.

6 苗彦霞，卫培峰，莫小丽.二色补血草对小鼠出、凝血时间影响的实验研究〔J〕.陕西中医，2008;29(6):751-2.

7 许莹堂，张爱平，李平菊.二色补血草花总黄酮化合物提取工艺研究〔J〕.文山师范高等专科学校学报，2005;18(2):122-4.