阿托伐他汀对糖尿病大鼠视网膜核因子－κB表达的影响

魏 薇 于晓静 王晓梅 隋 淼 朱瑞萍 李 湘

(大连大学附属中山医院内分泌科，辽宁 大连 116001)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)常见和严重的慢性并发症之一，是DM患者的主要致盲原因。病程20年以上的DM患者中，几乎全部的1型DM患者及60%的2型DM患者均可出现程度不同的视网膜病变〔1〕。核因子(NF)-κB作为一个具有多向性调节作用的核转录因子，对众多调节血管病变的细胞因子、黏附因子等均有调控作用，被视为DM微血管病变的中心调节因子〔2〕。随着对DR的深入研究，许多学者发现，NF-κB 在 DR 的发生、发展中起着重要作用〔3，4〕。阿托伐他汀是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂家族成员之一，近年发现，他汀类药物除了降血脂作用外，同时具有抗炎作用〔5〕。NF-κB的激活在DR的发生中起着重要作用。而阿托伐他汀是否可以通过抑制DM大鼠视网膜NF-κB的活性来改善DR，尚不清楚。本研究目的在于探讨阿托伐他汀对DM大鼠视网膜NF-κB的表达影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型复制 健康8周龄雄性SD大鼠60只，体重200～350 g，购于大连医科大学实验动物中心。随机抽取20只做正常对照组，其余大鼠以链脲左菌素65 mg/kg〔6〕的剂量进行一次进行腹腔注射。注射后72 h，常规消毒后，取尾静脉血少量，测量血糖，以血糖高于16.7 mmol/L〔7〕作为DM模型成功标准。成模的38只大鼠随机分成两组，即DM非药物干预组及DM阿托伐他汀干预组。阿托伐他汀干预组于成模后48 h，将阿托伐他汀溶于饮用水，按照每只大鼠体重2 mg·kg－1·d－1灌胃，糖尿病非药物干预组及正常对照组每天给予等量饮用水灌胃，共计24 w。分别于3个月和6个月药物治疗后，将3组大鼠各取8只取大鼠双眼，一只用10%中性甲醛固定制备病理切片，另一只置于－80℃冰箱用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测NF-κB mRNA 半定量RT-PCR检测NF-κB mRNA的表达:大连宝生物公司进行引物设计，NF-κB上游引物5'-CACCAAAGACCCACCTCACC-3'，下游引物5'-CCGCATTCAAGTATAGTCCC-3'(产物260 bp)。内参β-actin上游引物5'-CACACGCAGCTCATTG-3'，下游引物5'-AAGGACTCCTACGTTG-3'(产物141 bp)。用Trizol提取总RNA。PCR总反应体系25 μl，反应条件 NF-κB:94℃初变性 2 min，进入循环，94℃变性30 s，59℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，35 个循环后，72℃ 延伸10 min。β-actin:94℃初变性 2 min，进入循环，94℃变性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，35 个循环后，72℃ 延伸 10 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，扫描及半定量分析。

1.2.2 免疫组化方法检测 NF-κB表达:SABC法测定，DAB显色。检测方法严格按照说明书操作。显微镜下控制显色，阳性表达信号为棕黄色。PBS代替一抗做阴性对照。每个标本随机选取3张切片，每张切片随机选取3个200倍数高倍视野，细胞核棕黄着染者为阳性。计数标本的阳性细胞核数量的均值为结果，进行统计学分析。

1.3 统计学处理数据 采用SPSS17.0进行统计分析，数据以x±s表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 按照STZ 65 mg/kg进行腹腔注射。3 d后大鼠情况为:(1)大鼠生长情况:注射后的第1天死亡2只，第3天死亡1只，第5天死亡1只。(2)STZ大鼠与正常大鼠的外观相比，精神萎靡，行动迟缓，皮毛潮湿，垫料潮湿。36只大鼠血糖＞16.7 mmol/L，造模成功。血糖＜16.7 mmol/L的2只大鼠，待血糖恢复后，重新给予STZ 65 mg/kg一次性腹腔注射。各组大鼠血糖情况见表1。

2.2 RT-PCR法检测NF-κB的表达 见表2及图1。

2.3 免疫组化结果 显微镜下观察:在正常对照组3个月及正常对照组6个月，NF-κBp65在视网膜血管层有少许表达，在光镜下胞核呈棕黄色。DM组3个月与正常组3个月相比NF-κBp65阳性细胞数量在视网膜血管层表达增加，颜色加深呈深棕色。阿托伐他汀组3个月细胞数量较DM组3个月明显减少颜色也较其浅，但数量较正常组3个月多颜色较其深。DM6个月时，NF-κBp65阳性细胞数量在视网膜血管层表达最多，在节细胞层也有表达，颜色较DM 3个月组深。阿托伐他汀组6个月组细胞数量较DM 6个月组明显减少颜色也较其浅。见表2及图2。

表1 不同时期各组大鼠的血糖平均值(x ± s，mmol/L)

表2 各组大鼠视网膜NF-κB mRNA的表达比值(x ± s，n=8)

图1 PCR法检测NF-κB mRNA表达

图2 免疫组化图(DAB，×200)

3 讨论

DR是DM的眼部并发症之一，周细胞的选择性丧失是DR最早的病理改变。Romeo等〔8〕检测DM患者血管内凋亡的周细胞之后，发现激活的NF-κB在绝大多数凋亡的细胞内都可检测出来。NF-κB的激活是周细胞发生凋亡的信号通路的触发点，在DR的发生中起着重要作用。因此，通过药物干预的方式使NF-κB激活的各个环节受到抑制，是预防和治疗DR病变的一个重要的研究方向。

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂或他汀类，是胆固醇生成的强有力抑制剂，广泛用于治疗高脂血症〔9〕。近年发现，他汀类药物除了降血脂作用外，同时具有抗炎作用。目前已经认识到慢性炎症在动脉粥样硬化中发挥重要作用〔10〕。Bustons等〔11〕建立了家兔股动脉粥样硬化的动物模型，经4 w的阿托伐他汀治疗，治疗组家兔的血脂水平及病灶大小较非治疗组明显降低和缩小，动脉中的巨噬细胞浸润几乎被清除，NF-κB表达明显下调。最近的研究发现，DM患者应用阿托伐他汀治疗后可以提高其内皮的稳定性〔12〕。有学者认为他汀类药物抑制NF-κB活化的可能机制是他汀类药物抑制了p21ras途径的DNA合成过程〔13，14〕。干扰了ras介导的细胞信号转导，最终导致NF-κB活化受到抑制。

本研究说明在大鼠眼球中，NF-κB除在视网膜组织有表达外，在其他的组织也有表达。由于视网膜组织很薄，在制作标本过程中，染色很难操作，有的部位视网膜结构不是很完整，可能是取材固定所致，未必是DM所致的结构改变。本研究证实阿托伐他汀可以通过抑制NF-κB表达减轻DM大鼠视网膜组织的炎症反应，由于没有设置不同的阿托伐他汀剂量组，尚不能证实哪种剂量更安全有效。

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5 Song Y，Li C.Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factor-mediated extracellular matrix accumulation〔J〕.Exp Mol Pathol，2004;76(1):66-75.

6 Wei M，Ong L，Smith MT，et al.The streptozotocin-diabetic rat as a model of the chronic complication of human diabetes〔J〕.Heart，Lung Circulation，2003;12(1):44-50.

7 汪新蝤.医学实验动物学〔M〕.北京:人民军医出版社，2000:275-8.

8 Romeo G，Liu WH，Asnaghi V，et al.Activation of nuclear factor-kappa B induced by diabetes and high glucose regulates a proapoptotic program in retinal pericytes〔J〕.Diabetes，2002;51(7):2241-8.

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11 Bustons C，Hernandez-Presa MA，Ortego M，et al.HMG-CoA reductase inhibition by atorvastatin reduces neointimal inflammtion in a rabbit model of atherosclerosis〔J〕.Am Coll Cardiol，1998;32(7):2057-64.

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13 Vrtovsnik F，Couette S，Prie D，et al.Lovastatin-induced inhibition of renal epithelial tubular cell，proliferation involves a p21ras activated，AP-1-dependent pathway〔J〕.Kidney Int，1997;52(4):1016-27.

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