莪术油对乳腺癌癌前病变大鼠的治疗效果及作用机制

梁莉萍 贾存东

(新疆医科大学附属肿瘤医院病理科，新疆 乌鲁木齐 830011)

癌前病变是乳腺癌发生发展的必经阶段，而在该阶段采取积极的治疗措施可以延缓甚至逆转癌变的进程〔1〕。莪术油是我国传统中药，具有活血化瘀之功效，已被广泛应用于肝癌、大肠癌、胃癌等肿瘤的治疗中〔2，3〕。有研究显示莪术油对于乳腺癌癌前病变具有良好的治疗效果〔3〕，然而其深入的分子机制尚不清楚。本研究以化学致癌剂二甲基苯蒽(DMBA)诱导大鼠乳腺癌癌前病变模型，观察莪术油作用后，大鼠乳腺癌癌前病变组织病理形态及P53蛋白的表达改变。

1 资料与方法

1.1 实验动物和试剂 选择健康未育雌性SD大鼠80只，6周龄，清洁级，体重185～235 g，常规饲养1 w，适应环境后开始实验。DMBA(Sigma公司，产品编号165023)1 g加入100 ml芝麻油备用;莪术油注射液(哈尔滨三联药业有限公司，国药准字H20053467);康莱特注射液(浙江康莱特药业有限公司，国药准字Z20030004);他莫昔芬(江苏扬子江药业集团有限公司，国药准字H32021472);脱毛膏(广州市卡梅奥化妆品有限公司，批号:K005041302);即用型SABC试剂盒、DAB二氨基联苯胺显色试剂盒(上海长岛生物技术有限公司);兔抗人/大/小鼠P53抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);照相显微镜:Leica;显微数码摄像图像采集系统:Pixera;隔水式电热恒温培养箱:Thermo。

1.2 造模方法 动物适应环境1 w后，将DMBA 10 mg一次性灌胃后第2天起，按照5 d为1个周期，连续12个周期。第1～3天，每天腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，第4天，腹腔注射黄体酮4 mg/kg，停药1 d。

1.3 分组及给药方法 分为5组各15只:①空白对照组，一次性灌胃生理盐水10 ml/kg;第10周开始生理盐水10 ml/kg腹腔注射，常规饲养14 w;②疾病模型组，造模结束后，第10周开始生理盐水10 ml/kg腹腔注射，常规饲养14 w;③莪术油组，造模结束后，第10周开始莪术油20 ml/kg腹腔注射，治疗4 w;④康莱特组，造模结束后，第10周开始康莱特20 ml/kg腹腔注射，治疗4 w;⑤他莫昔芬组，造模结束后，第10周开始他莫昔芬20 ml/kg灌胃，治疗4 w。

1.4 观察指标 造模结束后，每日观察大鼠一般生理情况。实验结束前1 d用脱毛剂将大鼠胸部毛发去除，实验结束当天以1%戊巴比妥钠40 ml/kg腹腔注射麻醉后处死大鼠，取胸腹部第3、4、5对乳腺及其周围皮肤，皮下组织，经中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水后石蜡包埋切片，分成2份，1份经HE染色，光镜观察乳腺组织学情况，大鼠乳腺组织病理学诊断标准参照2003年AHO制定的分类标准〔4〕。另1份石蜡包埋组织切片采用SP二步法行免疫组织化学染色，检测P53蛋白表达情况。将获取的标本进行抗原修复，然后滴加3%过氧化酶阻断剂室温反应10 min以阻断内源性过氧化酶的活性。加一抗4℃冰箱过夜，依次加入生物素标记的二抗及SABC试剂，然后进行DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明封片。具体步骤参照即用型快捷免疫组化SABC试剂盒(鼠/兔)说明书。以PBS液代替一抗作为阴性对照，以已知阳性表达的宫颈癌标本作为阳性对照。

1.5 统计学方法 用SPSS10.0软件，数据用x±s表示，采用单因素方差分析，率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 大鼠存活情况 大鼠DMBA灌胃2 w后各组均陆续出现死亡。至试验结束时，空白对照组存活15只，疾病模型组，莪术油组和康莱特组各10只，他莫昔芬组9只，空白组死亡率显著低于其他组别(P＜0.05)。

2.2 大鼠试验后乳房病理学情况 疾病模型组与空白对照组在大鼠乳腺组织病理形态结构比上存在显著差异，前者出现癌前病变形态的比例更高(P＜0.05)。莪术油、康莱特及他莫昔芬乳腺癌癌前病变及浸润癌出现率均较疾病模型组低(P＜0.05)。其中，莪术油组乳腺癌癌前病变及浸润癌显著低于他莫昔芬组及康莱特组。见表1。

2.3 不同组别大鼠乳腺组织P53与Ki-67蛋白表达情况P53、Ki-67蛋白的表达主要在细胞核中，呈黄色或棕黄色。空白对照组大鼠乳腺组织中均未见P53、Ki-67蛋白表达。疾病模型组P53、Ki-67蛋白显著高于其他组别(P＜0.05)，莪术油、康莱特及他莫昔芬组P53、Ki-67表达水平无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠乳房病理学情况〔n(%)，n=15〕

表2 各组大鼠乳腺组织P53与Ki-67基因表达情况〔n(%)，n=15〕

3 讨论

流行病学研究结果表明，乳腺癌的发生是一个多阶段的模式，即“经乳腺导管上皮细胞一般增生-非典型增生-原位癌-浸润性癌变”的逐渐演变过程，在癌前病变期，即浸润性癌前阶段采取积极的干预措施可及时截断甚至逆转疾病的发展进程，取得满意的治疗效果〔1〕。遗憾的是，目前针对乳腺癌癌前病变尚无特异性的治疗药物，西药治疗往往具有较大的副作用，而中医药由于其安全、高效，个性化优势，在乳腺癌癌前病变的治疗中获得越来越多的关注。莪术油为传统中药莪术根茎中提取的挥发油，其主要活性成分为莪术醇和蓬术环氧酮、蓬莪术酮、蓬莪术环二烯等倍半倍萜类物质，具有抗肿瘤、抗血管生成、抗病毒、抗菌、抗炎等作用。宋爱莉等〔3〕研究发现莪术油可改善乳腺癌癌前病变造模大鼠的血液流变学，增加乳房的微循环灌注量，促进乳腺癌细胞凋亡。此外，殷玉坤等〔5〕对莪术油在乳腺癌癌前病变的应用进行了大量研究，均证实其可有效抑制乳腺癌的继续发展。本研究结果进一步证实了莪术油治疗乳腺癌癌前病变的确切疗效。

P53基因定位于人17号染色体(17p13.1)，包括11个外显子和10个内含子，是最受瞩目的抑癌基因。野生型P53蛋白半衰期短，积聚水平低，不宜测出，而突变型P53蛋白半衰期长，稳定性强，可用免疫组化方法检测到〔6〕。殷玉坤等〔5〕研究发现P53基因突变与乳腺癌的恶性程度相关。本研究显示莪术油治疗后，大鼠乳腺组织中P53蛋白表达降低，这可能是由于莪术油可降解突变型P53，甚至将其逆转为野生型P53。恶性肿瘤的基本特征之一是肿瘤细胞无限增殖，Ki-67表达在所有活动的细胞周期(G1，S，G2和有丝分裂期)，被认为是评价肿瘤细胞增殖程度的良好指标〔7〕。本研究显示莪术油可显著抑制Ki-67的表达，与国外研究〔8〕一致。

综上所述，莪术油可以显著延缓大鼠乳腺癌癌前病变的发生发展，抑癌基因P53与原癌基因Ki-67可能与其抑癌作用机制密切相关，因而可作为分子标志物用于临床乳腺癌癌前病变的诊断和治疗。

1 王 峰，马忠兵，方允治，等.乳腺癌癌前病变大鼠模型的建立〔J〕.中国现代普通外科进展，2009;12(5):387-10.

2 刘晓菲，宋爱莉，李静蔚，等.莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变MVD及相关调控因子VEGF/FLK表达的干预作用研究〔J〕.中医药学报，2011;39(4):212-5.

3 宋爱莉，张敬涛，李静蔚，等.莪术油对乳腺癌癌前病变造模大鼠血液流变学及乳房微循环的影响〔J〕.中华中医药学刊，2008;26(3):458-60.

4 B¨ocker W.WHO classification of breast tumors and tumors of the female genital organs:pathology and genetics〔J〕.Verh Dtsch Ges Pathol.2002;86:116-9.

5 殷玉坤，宋爱莉，李静蔚，等.莪术油对大鼠乳腺癌前病变组织中C-erbB-2，P53表达的影响〔J〕.中华中医药学刊，2012;30(6):1219-2.

6 王洪滨，张学新，苏 君，等.P53、Ki-67在不同级别胶质瘤中的表达及其意义〔J〕.中国误诊学杂志，2011;11(34):8361.

7 孙明霞，梦雅萍，张军力，等.Ki-67抗原在临床疾病中的研究进展〔J〕.内蒙古医学杂志，2009;41(11):1336-7.

8 Karmakar I，Dolai N，Suresh Kumar RB，et al.Antitumor activity and antioxidant property of Curcuma caesia against Ehrlich's ascites carcinoma bearing mice〔J〕.Pharm Biol，2013;51(6):753-9.