红芪多糖抗肝纤维化的药效作用

韩 涛 王一丹 吴国泰 史玉攀 郭 倩

(甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000)

近年来，文献报道中药复方、单味中药和中药有效成分抗肝纤维化取得诸多研究进展〔1，2〕。黄芪具有补中益气之功，在临床上常用于治疗慢性肝病。历代本草中红芪记载于黄芪项下，列为上品〔3，4〕，与黄芪的功效相似，多糖为红芪主要成分之一。本实验研究红芪多糖抗大鼠肝纤维化的药效作用。

1 材料与方法

1.1 药品 红芪多糖、黄芪多糖、红芪水煎液，均由甘肃中医学院药化实验室提供。二甲基亚硝胺(DMN)，购自天津市化学试剂研究所，批号:20110308。大鼠 ALT、AST、HA、LN、Hyp、PCⅢ、Ⅳ-C ELISA试剂盒，均购自上海源叶生物科技有限公司生产。生理盐水，购自四川科伦药业股份有限公司生产，批号:C11022108-1。

1.2 实验仪器 多功能时间分辨荧光免疫分析系统，芬兰wallacVICTOR2 1420研制。80-1型离心机，上海手术器械厂生产。

1.3 实验动物 Wistar大鼠，雌雄兼用，体重为(200±20)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(甘)2004-0006。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 Wistar大鼠70只，雌雄各半，随机分为7组:正常组(A组)、模型组(B组)、红芪多糖高剂量组(C组)、中剂量组(D组)、低剂量组(E组)、黄芪多糖组(F组)、红芪水煎液组(G组)，每组10只。

1.4.2 肝纤维化模型 按文献方法〔5〕，用生理盐水将DMN稀释至浓度为0.5%，除正常组外，其余各组大鼠腹腔注射DMN稀释液1 ml/kg，1 w连续3 d，1次/d，正常组腹腔注射等剂量生理盐水，共3 w。

1.4.3 动物给药 用红芪多糖10 ml/kg(60、30、15 mg/ml)分别对高、中、低剂量组灌胃给药，黄芪多糖组灌胃给药10 ml/kg(30 mg/ml)，红芪水煎液组灌胃给药10 ml/kg(0.27 g/ml)，正常组、模型组以等剂量生理盐水灌胃，1次/d，共4 w。每3天称1次大鼠体重，按照大鼠体重增加相应的增加给药量。

1.4.4 标本采集 末次给药后禁食12 h，各组大鼠股动脉取血4 ml，放置2 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液待测血清生化指标。立即脱颈椎处死大鼠，剖腹取肝脏观察大体外观后，取肝右叶相同部位0.5 g放入10%多聚甲醛中，HE和Masson染色，取剩余肝脏0.5 g制备10%肝组织匀浆，3 000 r/min，－20℃保存待测。

1.4.5 指标检测 ELISA法测定血清ALT、AST，肝组织HA、LN、Hyp、PCⅢ、Ⅳ-C。HE、Masson 染色观察肝组织变化，检测胶原纤维面积百分比(胶原纤维占整屏视野的百分比)。

1.5 统计学方法 计量数据以x±s表示。采用SPSS14.0软件统计运算，进行单因素方差分析，并用LSD程序进行组间差异分析。

2 结果

2.1 一般情况 DMN染毒期间观察可见，大鼠生长减慢，精神萎靡，反应迟钝，活动减少，饮食减少，粪便稀薄，皮毛皱而不洁，缺乏光泽。给药治疗期，红芪多糖各组、黄芪多糖组、红芪水煎液组各项生理体征恢复较快，其中红芪多糖高剂量组各项体征恢复尤为明显。

2.2 血清ALT、AST含量变化 肝纤维化模型组血清ALT、AST含量明显升高(P＜0.01)。给药干预后，与模型组相比，红芪多糖各组、黄芪多糖组、红芪水煎液组血清ALT、AST含量均明显降低(P＜0.01，P＜0.05)。红芪多糖中剂量组与黄芪多糖组、红芪多糖低剂量组与红芪水煎液组比较均无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清ALT、AST含量比较(x ± s，n=10)

2.3 肝组织HA、Hyp、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量变化 与模型组比较，红芪多糖各组、黄芪多糖组、红芪水煎液组肝组织HA、Hyp、LN、PCⅢ含量均明显降低(P＜0.01，P＜0.05)。红芪多糖高、中剂量组、黄芪多糖组Ⅳ-C含量明显降低(P＜0.05)。红芪多糖中剂量组与黄芪多糖组、红芪多糖低剂量组与红芪水煎液组比较，均无显著性差异(P＞0.05)。见表2、表3。

表2 各组大鼠肝组织HA、LN、Hyp含量比较(x ± s，n=10)

表3 各组大鼠肝组织PCⅢ、Ⅳ-C含量及胶原纤维面积比较(x ± s，n=10)

2.4 肝组织病理学改变

2.4.1 HE染色 ①正常组肝小叶结构清晰，肝小叶中央静脉扩张充血，肝细胞形态正常，呈放射状排列，汇管区小叶间静脉扩张充血，小叶间动脉、胆管形态正常。②模型组肝小叶结构紊乱不清，肝小叶中央静脉扩张充血，多数肝细胞体积增大，胞质及部分肝血窦疏松化。少数肝细胞体大分裂，偶见病理性核分裂像，汇管区有少量淋巴细胞浸润，多量纤维结缔组织增生并向肝小叶内伸入，并有小胆管增生，此外可见中央静脉周围也有不同程度的胶原纤维增生并沿肝窦散在分布，相互连接。③红芪多糖各组和黄芪多糖组肝小叶结构清晰，中央静脉及肝内小静脉扩张充血，肝索排列整齐，肝细胞水肿及坏死明显改善。偶见点状坏死灶，汇管区少量淋巴细胞浸润，极少量纤维组织增生与模型组比较明显改善，尤以红芪多糖高剂量组改善显著。见图1。

2.4.2 Masson胶原染色 ①正常组仅于汇管区静脉血管壁及胆管壁见少许胶原纤维沉积。②于汇管区及肝细胞索均见多量胶原纤维沉积。③红芪多糖各组和黄芪多糖组肝组织纤维胶原均有不同程度改善，胶原纤维受到明显抑制，肝小叶中央静脉及汇管区纤维明显减少，尤以红芪多糖高剂量组改善效果明显。见图2。

图1 各组大鼠肝组织切片HE染色(HE，×100)

图2 各组大鼠肝组织切片Masson染色(Masson，×100)

2.4.3 肝组织胶原纤维面积变化 与模型组比较，红芪多糖各组、黄芪多糖组、红芪水煎液组肝组织胶原纤维面积均明显减少(P＜0.01，P＜0.05)。红芪多糖低剂量组与红芪水煎液组比较有显著性差异(P＜0.05)。红芪多糖中剂量组与黄芪多糖组比较无显著性差异(P＞0.05)。见表3。

3 讨论

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的修复反应，是慢性肝病的共同病理学改变。肝纤维化持续发展可导致肝硬化，甚至肝癌〔6，7〕，因此研究肝纤维化的进程减缓和逆转是近些年来中医肝病研究的热点之一〔8〕。随着对肝纤维化发生机制认识的不断深化，现已证实肝纤维化是可逆性病变〔9〕。近年来中药抗肝纤维化的研究取得了较大的进展，汪少林等〔10〕认为肝纤维化的病机演变是一个动态变化的过程。仝欣等〔11〕用黄芪汤活性组分干预DMN诱导的肝纤维化大鼠，发现黄芪总苷和甘草酸是抗肝纤维化的有效成分，可抑制肝纤维化进展。周朝晖等〔12〕以甘草酸干预四氯化碳肝纤维化大鼠模型，2 w后大鼠肝脏炎症及肝纤维化程度减轻，可能是甘草酸抑制了smad2表达及上调smad7，使TGF-β信号传导受到抑制，阻止了HSC活化。

现代药理研究红芪具有促进机体免疫功能作用，提高特异性和非特异性免疫力，并对实验性肝损伤有一定保护作用〔13〕。本研究结果表明红芪多糖能降低肝纤维化血清ALT、AST水平，有降酶保肝作用。通过酶联免疫法检测证实，红芪多糖对肝纤维化HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、Hyp水平的升高有明显抑制作用，并发现相同剂量的红芪多糖、黄芪多糖药效作用相似。病理组织学观察结果，红芪多糖能明显抑制胶原的增生，减轻肝纤维化的程度。红芪多糖具有良好的抗肝纤维化作用，为临床应用红芪治疗肝纤维化提供了实验依据。

1 孔维涵.单味中药抗肝纤维化作用研究进展〔J〕.天津药学，2011;23(2):65-8.

2 李 季，叶 军，薛冬英，等.中药复方抗肝纤维化作用机制研究概况〔J〕.中医杂志，2011;52(3):253-6.

3 金智生，孙丹凤，汝亚琴，等.红芪多糖对实验性糖尿病胰岛素抵抗大鼠TNF-α的影响〔J〕.上海中医药杂志，2010;44(9):61-4.

4 江苏新医学院.中药大辞典〔M〕.上海:上海科学技术出版社，1986:2073.

5 李志钢，杨晋翔，张 伟，等.肝纤维化实验动物模型的建立与评价〔J〕.北京中医药大学学报，2009;16(4):43-6.

6 张 永，韩 宁，尹常健.柔肝抑纤抗DMN肝纤维化大鼠肝窦毛细血管的实验研究〔J〕.中华中医药学刊，2009;27(1):97-8.

7 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南〔J〕.中华肝病杂志，2011;19(1):13-24.

8 徐 翀.抗肝纤维化药物研究进展〔J〕.齐鲁药事，2011;30(7):404-9.

9 贾克明.加强对乙型病毒性肝炎治疗的研究〔J〕.中华内科杂志，2000;39(12):797-8.

10 汪少林，芦秀琴.中医药抗纤维化研究概况〔J〕.甘肃中医学院学报，2005;22(2):52-3.

11 仝 欣，陈高峰，陆 雁，等.基于均匀设计分析黄芪汤活性组分抗二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化的配伍作用〔J〕.中国中西医结合杂志，2011;31(10):1389-93.

12 周朝晖，蔡 瑜，沈锡中.甘草酸对四氯化碳肝纤维化大鼠肝组织smad 2免疫组织化学表达的影响〔J〕.肝脏，2006;11(1):35-6.

13 任 远，马 骏，崔笑梅，等.红芪多糖对实验性肝损伤的保护作用〔J〕.甘肃中医学院学报，2000;17(S1):59-60.