重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对1型糖尿病大鼠肾脏TGF－β1和VEGF表达的影响

应长江 林红晓 李 伟 (徐州医学院附属医院内分泌科，江苏 徐州 221002)

在我国，糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾衰竭(ESDR)的第二位疾病〔1，2〕。在遗传因素与长期高血糖等环境因素相互作用下，肾小球血流量、肾小球滤过率及压力增加，肾组织缺血、缺氧，细胞因子，多元醇途径活化及氧化应激等异常长期存在导致肾小球、肾小管和间质细胞合成细胞外基质蛋白(ECM)增多，肾小球基底膜(GBM)增厚和以肾小球系膜区为主的ECM积累，导致弥漫性和结节性肾小球硬化，出现蛋白尿及肾功能不全等表现〔3〕。实验证实:转化生长因子(TGF)-β1、血管内皮生长因子(VEGF)表达增加在DN发生发展过程中起重要作用，抑制肾组织中 TGF-β1、VEGF表达能够延缓 DN的进程〔4，5〕。血管抑素(AS)能够抑制肿瘤生长、新生血管形成、降低血管通透性〔6，7〕，治疗糖尿病视网膜病变，抑制病变血管通透性、保护血管内皮细胞、降低局部VEGF、增加色素上皮衍生因子(PEDF)、MMP 表达〔8，9〕。研究发现，AS 能够降低 DN 大鼠的蛋白尿。重组腺相关病毒介导血管抑素基因(rAAV-AS)由于其宿主范围广，免疫原性低，表达携带基因长久等，被广泛用于基因治疗的研究。本实验旨在探讨rAAV-AS对DN大鼠肾皮质中TGF-β1、VEGF表达的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 雄性SD大鼠，体重160～180 g，8周龄，由徐州医学院实验动物中心提供。在徐州医学院实验动物中心屏障系统饲养，室温控制在20℃ ～25℃，相对湿度62% ～80%，通风干燥、安静，12 h光照周期，自由摄食饮水，保持垫料干燥;所需大鼠饲料购自徐州医学院实验动物中心。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，rAAV-AS由本元正阳公司构建。尿白蛋白放免试剂盒购自北京福瑞生物工程公司。

1.2 实验分组和模型制备 40只清洁级雄性SD大鼠适应性喂养标准大鼠饲料1 w后，从中随机抽取10只作为正常对照组(NC组)，其余造模为糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射STZ 60 mg/kg，NC组仅注射枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。72 h后尾静脉测血糖大于16.7 mmol/L认为造模成功，适应性喂养1 w后，把糖尿病大鼠随机分为DN组(n=10)，重组腺相关病毒空载体组(rAAV-0，n=10)，rAAV-AS治疗组(AS组，n=10，2×1012VG/kg)。大鼠尾静脉分别注射rAAV-AS或同等剂量的生理盐水，rAAV-0组注射同等剂量rAAV-0空载体;从第2周起，整个实验过程共持续8 w。

1.3 标本收集 各组大鼠于8 w末测量体重，尾静脉取血测定血糖，用代谢笼收集24 h尿液、离心，保存于－40℃冰箱中，以待测尿白蛋白。大鼠隔夜空腹，1%的戊巴比妥钠(50 mg/kg腹腔注射)麻醉下心脏采血、离心、取上清，－40℃冰箱保存，以备测定糖化血红蛋白(HbA1c)。然后，取大鼠双肾，留取行免疫印迹法检测。

1.4 生化指标检测 胶体金双抗体夹心法检测MAU，葡萄糖氧化酶法检测血糖，分析法检测HbA1c。

1.5 免疫组化染色 4 μm厚石蜡切片脱蜡、抗原修复，3%H2O2孵育，分别滴加兔抗大鼠TGF-β1和VEGF(1∶50)多克隆抗体，复温30 min;PBS冲洗，滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加新鲜配制的DAB溶液，苏木素复染，水洗;1%盐酸酒精分化，水洗;碳酸锂蓝化，脱水、透明、中性树胶封固。结果:阳性反应为棕黄色或黄褐色颗粒沉积。将免疫组化切片图像通过图像采集系统(高倍镜，×400)，每张标本按顺序选5个肾小球，采用Image-ProPlus 6.0图像分析软件测定每个视野中免疫组化阳性表达的IOD累积光密度。

1.6 免疫印迹法

1.6.1 胞浆和胞核蛋白提取液制备 剪取的肾组织，加入Buffer A，匀浆器3 000 r/min匀15次，离心15 min得上清及沉淀。上清离心15 min后所得上清即为胞浆蛋白提取液。沉淀加Buffer A，离心15 min洗一次，弃去上清，取沉淀加buffer B，DNA混合器4℃摇匀0.5 h，离心15 min，取上清即为胞核蛋白提取液。

1.6.2 蛋白浓度的测定 以牛血清白蛋白为标准品。

1.6.3 蛋白免疫印迹法 测定抗血管生成抑制因子抗体、βcatin的蛋白表达量及其活性的变化。将已制备的细胞胞浆或胞核蛋白提取液各取10 μl测其蛋白浓度后，将各样品用匀浆液稀释至相同浓度，加入1/3体积的4倍蛋白变性液95℃～100℃水浴变性5 min;取等量蛋白样品(50～100 μg)加入10%SDS-PAGE分离后，以湿转移法转至NC膜上，加入3%封闭液，室温封闭3 h;加入一抗(p-AS 1∶200)，4℃过夜，WB洗膜6 min×3次;分别加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗，室温孵育2 h，WB洗膜6 min×3次;加入显色剂(NBT/NCIP显色试剂盒)，反应达到要求后流水洗涤终止反应。所得显色条带经图像处理仪行激光扫描、定量分析及打印。对照实验以双蒸水代替一抗，其余操作相同。上述因子的蛋白激活水平分别以其免疫反应活性，即免疫印迹中相应区带的光密度(OD)值相对于对照组的倍数表示。

2 结果

2.1 一般情况 实验中5只大鼠可能因血糖过高死亡。实验结束时共存活大鼠35只，其中 NC组10只，DN组8只，rAAV-0组9只，AS组8只。NC组大鼠精神较好，毛发光泽，体重增加，行动敏捷，食欲好，每天添加1次食物，每周换1次垫料，垫料无异味;DN组大鼠血糖明显升高并出现多饮、多尿、多食、消瘦等典型“三多一少”的糖尿病表现，精神萎靡，毛色晦暗无光泽，体重减轻，行动迟缓，食欲差，易死亡;rAAV-0组和DN组大鼠表现类似;AS组大鼠精神一般，毛发无明显晦暗，体重增加，行动可，食欲好，每2天添加1次食物，每周换2次垫料。

2.2 各组大鼠生化指标变化 与NC组比，DN、rAAV-0、AS组BG、HbA1c、MAU明显增高(P ＜0.05);与DN组相比，AS组MAU明显降低(P＜0.05);与rAAV-0组相比，AS组MAU明显降低(P＜0.05)。见表1。

2.3 免疫印迹法测肾组织中AS表达情况 与NC组(0.78±0.26)比较，DN组和 rAAV-0组表达 AS较少(0.12±0.28，0.12±0.29，P＜0.05);与DN组相比，AS组大鼠肾组织中AS表达明显增多(0.51±0.52，P＜0.05);与rAAV-0组相比，AS组大鼠肾组织中AS表达明显增多(P＜0.05)。见图1。

2.4 光镜 HE染色:NC组大鼠肾小管、小管间质区结构清楚，肾小球细胞数目正常，毛细血管腔均匀一致，无狭窄，肾小管上皮细胞大小一致，排列整齐;基底膜完整，间质中未见炎症细胞和纤维组织增生。与NC组大鼠相比，DN组病变较明显:肾小球细胞数显著增多，毛细血管袢塌陷，管腔闭塞，肾小球明显体积增大，肾小球基底膜增厚、肾小球系膜基质增生、淋巴细胞数量增多，出现玻璃样变;肾小管尤其是近曲小管肿胀、变性、空泡形成，肾间质可见大量淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润。rAAV-0组较DN组未见改善，AS组上述病变较DN组有改善，可见肾小球细胞数教多，毛细血管腔轻度狭窄，肾小管-间质见少量淋巴细胞浸润。见图2。

2.5 免疫组化结果 与NC组比较，DN组、rAAV-0组TGF-β1和VEGF表达明显增加，呈强阳性(P＜0.05);与DN组比较，AS组TGF-β1和VEGF表达明显降低(P＜0.05);与rAAV-0组比较，AS组TGF-β1和VEGF表达明显降低，差异有统计学差异(P ＜0.05)。见表2，图3，图4。

表1 rAAV-AS对DN大鼠生化指标的影响(±s)

表1 rAAV-AS对DN大鼠生化指标的影响(±s)

与NC组比较:1)P＜0.05;与DN组比较:2)P＜0.05;与rAAV-0组比较:3)P ＜0.05，下表同

组别 n BG(mmol/L) HbA1c(%) MAU(μg/24 h)10 6.54±1.51 6.77±1.10 9.20±1.87 DN组 8 22.30±2.091) 14.29±1.781) 107.75±2.781)rAAV-0组 9 21.91±1.341) 13.74±3.201) 103.59±3.711)AS组 8 23.17±1.341) 14.83±3.201)80.46±3.711)2)3)NC组

图1 各组AS免疫印迹表达

图2 各组大鼠肾脏组织学形态(HE，×400)

图3 各组大鼠肾脏组织(DAB，×40)

图4 各组大鼠肾脏组织(DAB，×400)

表2 各组大鼠肾脏组织TGF-β1和VEGF表达(±s)

表2 各组大鼠肾脏组织TGF-β1和VEGF表达(±s)

组别 n TGF-β1VEGF NC组10 8.89±1.61 7.54±0.85 DN组 8 83.95±4.721) 79.30±3.781)rAAV-0组 9 81.09±4.891) 73.91±4.781)AS组 8 34.30±2.711)2)3) 36.30±1.131)2)3)

3 讨论

DN表现为肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚、细胞外基质积聚致系膜区扩张，最后导致肾小球纤维化、硬化。研究表明DN早期TGF-β1通过受体信号传递(通过Smad基因)调节细胞增殖和分化，并抑制近曲小管上皮细胞、肾小球上皮细胞和肾小球内皮细胞的增殖分化TGF-β1能阻止肾小管上皮细胞从G1期过渡到S期，使RNA蛋白质合成增加，导致ECM增厚引起微量蛋白尿。足细胞受VEGF刺激分泌一些物质能增加肾小球毛细血管的大分子通透性，内皮细胞受VEGF刺激后胶原酶合成增加，分解GBM蛋白，从而破坏肾小球滤过膜，引起蛋白尿。VEGF在增加内皮细胞通透性使大量血浆蛋白漏出的同时伴纤维蛋白及一些黏附分子的漏出。上述物质可在血管周围形成一层细胞外基质，为随后细胞外基质的形成和堆积提供了良好的条件。在此基础上，GBM增厚，系膜病变加重，出现大量蛋白尿，最终发展成为肾小球硬化〔6，7，10〕。

1994 年，首次从Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分离出AS，并发现AS是一种能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子，是大分子物质纤溶酶原的一个片段，目前国内外研究AS对DN的作用很少。AS基因注射宿主，转染效率低、安全性差而且费用高昂，AAV是一种无包膜的人单链DNA病毒，重组AAV由于其宿主范围广，免疫原性低，表达携带基因长久等优点而越来越多地被用于基因治疗的实验研究。

本实验表明:腺相关病毒空载体没有对DN肾脏起保护作用，只是起载体作用;腺相关病毒介导血管抑素对DN肾脏有保护作用，而且不依赖血糖降低，可通过降低TGF-β和 VEGF表达而起作用。

综上，rAAV-AS对DN早期起保护作用，且这种保护作用可能通过降低TGF-β1和VEGF的表达有关，rAAV-AS对DN的保护作用的具体机制我们将在今后的实验中继续探讨。

1 Collins AJ，Kasiske B，Herzog C，et al.United States Renal Data System 2006 Annual Data Report Abstract〔J〕.Am J Kidney Dis，2007;49(Suppl 1):A6-7，S1-296.

2 中华医学会肾脏病分会透析移植工作组.1999年度全国透析移植登记报告〔J〕.中华肾脏病杂志，2001;17(2):77-8.

3 Gross JL，de Azevedo MJ，Silveiro SP，et al.Diabetic nephropathy:diagnosis，prevention，and treatment〔J〕.Diabetes Care，2005;28(1):164-76.

4 Chen S，MC Iglesias-de la Scruz，Jim B，et al.Reversibility of established diabetic glomerulopathy by anti-TGF-beta antibodies in db/db mice〔J〕.Biophys Res Commun，2003;300(1):16-22.

5 Sung SH，Ziyadeh FN，Wang A，et al.Blockade of VEGF signaling ameliorates diabetic albuminuria in mice〔J〕.J Am Soc Nephrol，2006;17(11):3093-104.

6 Wang A，Ziyadeh FN，Lee EY，et al.Interference with TGF beta signaling by Smad3-knockout in mice limits diabetic glomerulosclerosis without affecting albuminuria〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2007;293(5):1657-65.

7 Cha DR，Kang YS，Han SY，et al.Vascular endothelial growth factor is increased during early stage of diabetic nephropathy in typeⅡdiabetic rats〔J〕.J Endol Scrinol，2004;183(1):183-94.

8 Raisler BJ，Berns KI，Grant MB，et al.Adeno-associated virus type-2 expression of pigmented epithelium-derived factor or Kringles 1-3 of angiostatin reduce retinal neovascularization〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2002;99(13):8909-14.

9 Sima J，Zhang SX，Shao C，et al.The effect of angiostatin on vascular leakage and VEGF expression in rat retina〔J〕.FEBS Lett，2004;564(1-2):19-23.

10 Dronavalli S，Duka I，Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕.Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008;4(8):44-52.

11 O'Reilly MS，Holmgre L，Shiny Y，et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a lewis lung carcinoma〔J〕.Cell，1994;79(2):315-28.