大鼠急性缺血性脑损伤后星形胶质细胞的活动及药物对其的影响

叶素红 陈卫松 王晓蓉

(浙江大学金华医院神经内科，浙江 金华 321000)

急性缺血性脑卒中在临床上非常常见，具有高发病率、高致死率、高致残率，已成为威胁人类健康的主要疾病之一。目前对缺血性脑卒中的脑保护研究日益受到重视，其中星形胶质细胞(AS)脑保护作用的研究一直倍受关注。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是AS胞浆内一种重要的骨架蛋白，是AS特征性标志蛋白〔1〕。GFAP在AS受到刺激引起反应时表达发生变化，因此可用GFAP特异性地标记AS，被认为是AS活化的标志。本研究拟探讨甘露醇对缺血性脑损伤后AS活动的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 健康雄性SD大鼠，体重240～280 g，SPF级，每笼6～8只群养，饲养条件为自由摄食、饮水，12 h光照。环境温度18℃ ～20℃，相对湿度50% ～70%。试剂:10%水合氯醛，乙醚，肝素钠;碘伏，75%酒精，0.9%生理盐水;20%甘露醇(250 ml/袋)，注射用无菌用水;4%多聚甲醛，多聚赖氨酸;兔抗GFAP，生物素标记山羊抗兔IgG，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)，3，3'-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 分组 按体重编号，采取读取随机数的方法将大鼠随机分成0剂量组、小剂量组、中剂量组、大剂量组，以1∶2∶2∶2的比例分配，所有大鼠都建立缺血再灌注模型，最后每组6只大鼠入组。

1.2.2 大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型制作 称重后经腹腔按0.35 ml/100 g〔2〕注射水合氯醛麻醉，约6～10 min麻醉至仰卧不能自己翻正。固定大鼠，消毒、铺无菌洞巾。完全暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。ECA的分支枕动脉不必结扎，不分离出ICA的第一个分支PPA〔3〕。ICA远端用微动脉夹夹闭;距CCA分叉2～3 mm处将CCA剪一小口，插入栓线，栓线进入ICA，轻柔推进，插入深度距分叉处约(18.2±0.5)mm〔4〕。此时栓线头端正好位于大脑前动脉(MCA)起始部，栓线侧壁即对MCA造成阻断，造成单侧MCAO模型。结扎血管、固定好尼龙线，将线头埋入皮下，缝合皮肤。栓线堵塞后开始计时，2 h后用乙醚快速麻醉。轻柔拔出栓线约10 mm，在结扎线附近剪断，缝合皮肤，制成缺血再灌注模型。

1.2.3 给药 从大鼠建立缺血再灌注模型开始，通过大鼠尾静脉用微泵缓慢注射甘露醇到大鼠体内，6 h注射一次。采用小(10 ml/kg)、中(15 ml/kg)、大(20 ml/kg)〔5〕三个不同的剂量对模型组大鼠用药，0剂量组注射等量的无菌注射用水。

1.2.4 评分标准 麻醉苏醒后即观察大鼠:①神经行为学表现，并参考Longa等〔6〕的5级4分法标准进行评分:0分:无神经功能缺损症状;1分:提尾不能伸展对侧前爪;2分:行走向对侧转圈;3分:行走困难，并向对侧倾倒;4分:不能自发行走，意识障碍。②HE染色:将存活24 h或72 h的大鼠麻醉断头取脑，浸于4%多聚甲醛24 h，取出并切片做HE染色。造模成功率部分参考沈斌等〔7〕制定的标准:以至少存活24 h、评分1～3分、HE染色可见明显缺血灶为造模成功标准。

1.2.5 结果观察 固定两个人对所有入组的每只大鼠在四个时间点(再灌注后0 h、24 h、48 h、72 h)进行 mNSS 评分;在72 h后断头取脑，约平对耳线前方5.4 mm的平面切断大鼠脑，切取该切面前后3 mm的两块脑组织制作石蜡切块，制作免疫组化切片。10×20倍显微镜下观察缺血周边GFAP阳性细胞数目，每个区域随机选择三个相邻视野计算平均值。

1.3 统计学方法 实验数据以x±s表示，含一个重复测量因素的两因素定量资料用重复测量数据的方差分析，单因素多水平的定量资料用单因素方差分析，两两水平之间的比较用Tukey法或LSD法，两变量间的相关关系采用Pearson相关分析，所有数据均由SPSS13.0统计软件处理。

2 结果

2.1 模型组大鼠不同剂量甘露醇再灌注后不同时点神经功能缺损表现 0剂量组的mNSS评分值和小、中、大剂量组的差别均有统计学意义，P=0.023、0.026、0.019，而不同剂量对 mNSS值的影响差异无统计学意义(P=0.972)。见表1。

2.2 模型组大鼠应用不同剂量甘露醇3 d(72 h)后的缺血周边区GFAP阳性细胞数目的变化 不同剂量组缺血周边GFAP数目不完全相同，0、小、中、大剂量组GFAP数目分别为15.79±3.21、22.19±2.98、25.30±2.16、24.62±3.83，Tukey HSD 法多重比较结果:0剂量分别和小、中、大剂量组比较差别有统计学意义，P=0.010、0.008、0.004，LSD 法的结果亦类似。而小、中、大剂量组间经Student-Newman-Keuls法和Tukey HSD法检验，P=0.812、0.896。表明三个不同剂量组间缺血周边GFAP数目差异无统计学意义。

2.3 24只大鼠缺血再灌注72 h的mNSS和其对应的再灌注72 h后的缺血周边的GFAP阳性细胞数目直线相关分析 两组数据Pearson相关系数为－0.828(P=0.005)，表明两者具有负相关性。

表1 模型组大鼠使用不同剂量甘露醇后mNSS比较(x ±s，n=6)

3 讨论

缺血性脑血管疾病是人类最常见的脑血管病之一，其中MCA是其好发部位，约占60%以上。大鼠脑血管与人类相似，故认为大鼠是建立脑缺血模型的最佳动物。甘露醇对缺血性脑损伤后AS活动影响的研究鲜有报道，故本实验选择了甘露醇这个实验因素，观察较常用的甘露醇对急性缺血性脑损伤后AS反应性活动的影响。同时考虑到甘露醇脱水降颅压作用有可能改善mNSS评分，本实验采用持续静脉缓慢滴注的方法，使其脱水、降颅压作用不明显，减少该方面的影响。

本实验结果表明，在急性缺血性脑损伤后用甘露醇，均有随再灌注后时间增加而mNSS评分值变小的趋势，但未用甘露醇组的评分值下降的幅度明显比用了甘露醇的三组(小、中、大剂量组)小，由此可知应用甘露醇比未用者可以明显改善缺血再灌注后的mNSS值，而小、中、大剂量组间对降低再灌注后mNSS值幅度的差别不明显，可认为在一定程度上所用甘露醇的剂量对改善大鼠神经功能缺损状况无明显影响。在再灌注后72 h，四个剂量组间缺血周边的GFAP阳性细胞数目有明显差别，未用甘露醇组(0剂量组)GFAP阳性细胞数目明显小于小、中、大剂量组，而后三组间未见明显差别，由此可认为，应用甘露醇后可以明显增加缺血再灌注后GFAP阳性细胞数目，而一定程度上尚未发现所用甘露醇的剂量对增加GFAP阳性细胞数目有明显影响。由于不同剂量甘露醇改善mNSS值及增加缺血周边GFAP阳性细胞数目的趋势类似，所以对再灌注后72 h的各组mNSS值和再灌注后72 h相应各组的缺血周边GFAP阳性细胞数目进行Pearson相关分析，发现评分值和缺血周边GFAP阳性细胞间均具有负相关性。缺血周边GFAP阳性细胞数目越多，大鼠mNSS值越小。故有理由推测AS数目增多可能是改善mNSS值的主要原因之一，可能有脑保护的作用，通过使缺血周边AS反应性增生，改善大鼠mNSS值是其可能的机制之一。但本实验的不足之处在于:AS数目增多即反应性活动加强对脑组织具有利弊两面性，急性脑损伤后缺血周边AS反应性活动在何时利大于弊或何时弊大于利尚不清楚。故对界定急性脑损伤后缺血周边AS反应性活动发挥脑保护和脑损伤作用的时间段，值得进一步深入研究。

1 Dietrich WD，Truetter J，Zhao W，et al.Sequential changes in glial fibrillary acidic protein and expression following parasagittal fluid-percussion brain injury in rats〔J〕.Neurotrauma，2005;16:567-81.

2 高善荣，杜闻伟，曾 丽，等.不同厂家葛根素注射剂防治实验性大鼠脑损伤的比较研究〔J〕.中国实验方剂学杂志，2005;(5):31-2.

3 吴 莹，陈文荣，吴春泽，等.栓线法大鼠局灶性脑缺血模型的建立与改进〔J〕.汕头大学医学院学报，1999;12(1):23-5.

4 Carcia TH.A reliable method to occlued a middle cerebral artery in Wistar rats〔J〕.Stroke，1993;24(9):1423.

5 赵振伟，曲友直，高国栋，等.甘露醇与尼莫通联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究〔J〕.Clin Neurol June，2005;18(3):204-6.

6 Longa EZ，Weinsten PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

7 沈 斌，XuHaoliang.线栓法制备SD大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的改良研究〔J〕.首都医科大学学报，2007;28(6):782-4.