乳酸细菌甘露醇脱氢酶研究进展

林 谦

玉林师范学院生物系，广西玉林 537000

甘露醇（mannitol），又称D-甘露糖醇，分子式为C6H14O6，与山梨醇为同分异构体。甘露醇广泛存在于自然界生物体中，在医药、食品、化工和轻工行业有着广泛的应用。在医药行业，甘露醇主要被作为注射液使用，用作片剂的赋形剂，降脑内压、眼内压的降压剂，利尿剂，抗肿瘤、降血脂、降胆固醇等药物。在食品中，可作为适于糖尿病患者食用的甜味剂。由于世界范围内食品行业尤其是口香糖对甘露醇需求量快速增加，甘露醇市场需求迅速增长。

甘露醇的制备方法有化学法和生物法。目前，在工业上制备甘露醇的方法是化学法，由于产率较低，且有大量副产物山梨醇的产生，给甘露醇的分离和纯化带来了困难。

甘露醇的生物法制备有海带提取法、酶转化法和微生物发酵法。海带提取法生产流程长，提取率低，污染严重，产品质量无法满足下游产品的要求，精制工艺麻烦，导致成本的增加，产品缺乏市场竞争力。酶转化法是利用甘露醇脱氢酶将果糖转化成甘露醇，由于反应中需要提供NADH或NADPH，这两者的价格昂贵，且产物对甘露醇脱氢酶具有强烈的抑制作用，因此从工业生产来看并不合适。微生物发酵法中可利用酵母或乳酸细菌来生产甘露醇。乳酸细菌生产甘露醇，具有明显的优点：甘露醇为主要产物，同时产乳酸、乙酸、乙酸和二氧化碳，不产山梨醇，易于纯化分离及精制，并且条件温和，转化率高。因此乳酸细菌发酵法制备甘露醇具有极大的发展潜力。

甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase）是异型发酵乳酸细菌中合成甘露醇的唯一酶，一种依赖于NADH（EC 1.1.1.67），另一种依赖于NADPH (EC 1.1.1.138)，催化果糖与甘露醇的相互转化：

果糖+NAD(P)H+H+→甘露醇+NAD(P)+

同型发酵乳酸细菌也可产生少量的甘露醇，但并非由甘露醇脱氢酶催化，而是由甘露醇-1-磷酸酶将甘露醇-1-磷酸转化成甘露醇；此外，同型发酵乳酸细菌普遍可利用甘露醇作为碳源。异型发酵乳酸细菌的甘露醇产量高于同型发酵乳酸细菌，因此应用前者生产甘露醇的研究报道最多。

1 乳酸细菌甘露醇脱氢酶的作用

甘露醇脱氢酶只在异型发酵乳酸细菌中发现，这些细菌缺乏1，6-二磷酸果糖酶，通过6-磷酸葡萄糖酸/磷酸酮酶发酵六碳糖（如图1）。在厌氧条件下葡萄糖转化成乳酸、乙醇和二氧化碳，每摩尔葡萄糖发酵净产生一摩尔ATP。如果乙酰磷酸转化成乙酸，则额外产生一个ATP分子。此时NAD+的再生需要一个电子受体。果糖作为甘露醇脱氢酶催化反应的电子受体，转化成甘露醇。

2 乳酸细菌甘露醇脱氢酶的性质

在异型发酵乳酸细菌中，已有几个菌种的甘露醇脱氢酶被纯化。它们分别属于Leuconostoc和Lactobacillus两个属。

Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291的甘露醇脱氢酶分子量为155kDa，亚基分子量为43kDa，因此推测其由四个相同的亚基组成。依赖于NADPH，以NADH作辅酶时活力下降为32%。基因含1 017bp，氨基酸序列比对显示该酶属于含锌的中等长度链醇脱氢酶/还原酶家族。Leuconostoc mesenteroides ATCC 9135的甘露醇脱氢酶分子量为137kDa，包含4个相同的38kDa的亚基，还原果糖的最佳反应PH为5.35，米氏常数为0.035M, 氧化甘露醇的最佳反应PH为8.6，米氏常数为0.020M。该酶的基因mdh含1014bp，酶的活性特异依赖于NAD。

图1 异型发酵乳酸细菌己糖代谢示意简图注：1. 甘露醇脱氢酶；2. 果糖激酶；3. 葡萄糖磷酸异构酶

Lactobacillus intermedius NRRL B-3693的甘露醇脱氢酶等电点为PH 4.7，还原果糖的最佳反应温度为35℃，50℃下活力下降为44%，60℃时活力下降为15%，最佳反应PH为5.5，PH 6.5时活力下降一半，PH 3.5时活力下降为35%。氧化甘露醇的最佳反应PH为7.0。纯酶在PH 4.5～8.0之间保持稳定，温度在低于35℃时保持稳定。以NADPH作辅酶时的活力比以NADH作辅酶要高4.27倍，因此是NADPH依赖型的甘露醇脱氢酶。Lactobacillus sanfranciscensis TMW1.392的甘露醇脱氢酶表观分子量为44kDa，还原果糖的Km值为24mM，氧化甘露醇的Km值为78mM。最佳反应温度为35℃，最佳反应PH介于5.8～8之间。Lactobacillus brevis ATCC 367的甘露醇脱氢酶还原果糖的最佳反应PH为5.35，氧化甘露醇的最佳反应PH为8.6。NADH或NADPH辅酶对酶反应具有相近的影响。该酶基因与L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides的甘露醇脱氢酶基因分别具有75.4%和74.6的相似度。Lactobacillus reuteri ATCC 53608的甘露醇脱氢酶基因含1 008bp，酶分子量推算为36kDa，凝胶过滤显示其为二聚体。最佳反应温度为37℃，还原果糖的最佳反应PH为5.4，氧化甘露醇的最佳反应PH为6.2。每个亚基含一个催化性的锌。

从这几个甘露醇脱氢酶的性质来看，它们的最佳反应温度、反应PH、亚基分子量、氨基酸序列相当接近，但亚基的数目有显著不同。辅酶的种类大多为NADH，少数为NADPH。在有报道的甘露醇脱氢酶中，Lactobacillus intermedius、Lactobacillus sanfranciscensis的编码基因尚未被克隆出来。

3 展望

目前发现可产甘露醇的乳酸细菌种类较少，除了上述几种外，另几个菌种并没有甘露醇脱氢酶的详细报道，如Lactobacillus fermentum、Lactobacillus buchneri、Oenococcus oeni等。乳酸细菌发酵生产甘露醇的能力仍然偏低，要使产甘露醇的乳酸细菌走向实际应用，必须对它们的甘露醇脱氢酶进行深入的研究，从分子水平上了解其催化反应机制，并对其结构进行改造以提高生产甘露醇的能力。乳酸细菌的甘露醇脱氢酶虽然是生成甘露醇的关键酶，但己糖的代谢涉及到多个反应，从整个代谢网络来考虑，应用代谢工程的手段对乳酸细菌改造其代谢途径可能会是实现甘露醇工业发酵的最终手段。

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