头孢曲松预处理对局灶性脑缺血大鼠脑组织TLR4和TNF-α蛋白表达的影响

刘 畅 巴晓红 闵连秋 刘学文 姜兴千 程 雪

(辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁 锦州 121001)

近年来免疫炎症反应在缺血性脑损伤中的作用已得到肯定。炎性细胞在脑缺血时激活，并产生级联效应导致缺血部位的免疫炎症反应，进而加重神经系统的损害。Toll样受体(TLR)的发现促进了人们对炎性机制的理解。TLR4是小胶质细胞行使免疫功能的信号转导受体之一，TLR4信号成为一个激活小胶质细胞和调节其功能的重要控制开关〔1〕。头孢曲松能够显著改善缺血半暗带内神经元的存活率〔2〕，但具体机制尚不清楚。本实验研究头孢曲松对局灶性脑缺血大鼠脑组织TLR4及TNF-α的作用，探讨其神经保护作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 24只健康成年SD大鼠，雌雄各半，体重280～320 g〔由辽宁医学院动物实验中心提供，许可证号:SCXK(辽)2003-1007〕。随机分为缺血组、头孢曲松钠预处理组及假手术组，每组8只。

1.2 给药方法 头孢曲松钠:由上海新先锋药业有限公司提供(规格1.0 g，批号080560);TLR4和TNF-α试剂盒均购自武汉博士德生物试剂公司。预处理组每日腹腔注射(ip)头孢曲松钠，200 mg/kg，共5 d，假手术组和缺血组给予等量的生理盐水腹腔注射，给药方法及疗程相同。

1.3 大鼠局灶性脑缺血模型的建立 参照文献〔3〕，大鼠中动脉阻塞模型(MCAO)术前12 h禁食，以防手术时误吸，不禁水。以10%水合氯醛麻醉，沿颈部正中行2～3 cm切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及翼腭动脉。结扎颈总动脉近心端及翼腭动脉，在颈总动脉分叉处结扎颈外动脉远心端。于颈内动脉近心端置动脉夹夹闭，距颈总动脉分叉处近心端0.5 cm处将颈总动脉剪一小口，插入备好的尼龙线栓，去除动脉夹，沿颈内动脉轻轻向前推进至大脑前动脉(深约18 mm)，结扎颈内动脉并固定线栓。假手术组不插入线栓，其余过程相同。模型成功的判断标准为大鼠即刻出现同侧Horner征。

1.4 神经行为学评分 参考Zea Longa法〔4〕5分制评分标准:①0分:无神经缺损症状。②1分:轻微神经缺损症状，不能完全伸展对侧前爪。③2分:中度局灶性神经缺损症状，爬行时向对侧转圈。④3分:重度局灶性神经缺损症状，行走时向对侧倾斜。⑤4分:不能自发行走，意识改变。于大鼠MCAO术后约2 h清醒至24 h内进行3次评分，取平均值。

1.5 缺血脑组织TLR4和TNF-α免疫组化法检测 术后24 h取材。水合氯醛腹腔注射麻醉后，于颈正中偏右切开，以4%多聚甲醛约50 ml局部灌流内固定后，断头取脑。依次酒精脱水，石蜡包埋，行5μm厚的连续切片。①常规脱蜡、水化;②高压热修复抗原;③滴加正常山羊血清封闭液;④滴加1∶100稀释的TLR4及TNF-α一抗，4℃下过夜;⑤添加生物素化二抗;⑥滴加试剂SABC;⑦DAB显色;⑧苏木素复染;⑨脱水、透明、封片。于每片右侧顶叶皮层和海马CA1区各取10个高倍镜视野(10×40)，胞质有棕色颗粒者为阳性细胞(TLR4及TNF-α蛋白阳性细胞均为胞质染色)，取每个视野阳性细胞数平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析和t检验，用x±s表示。

2 结果

2.1 各组大鼠神经行为学评分的变化 缺血组神经功能评分(2.48±0.93)较假手术组(0)显著升高(P＜0.01)，头孢曲松预处理组(1.52±0.80)则低于缺血组(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠海马CA1区TLR4表达的比较 假手术组可见存在少量TLR4阳性细胞;缺血组大鼠脑组织中TLR4阳性细胞率高于假手术组(P＜0.01);与缺血组比较，预处理组TLR4阳性细胞数显著减少(P＜0.01)。见图1和表1。

2.3 各组大鼠海马CA1区TNF-α蛋白表达的影响 假手术组TNF-α少量表达，脑缺血组TNF-α表达迅速上升，部位主要分布于海马组织和缺血半暗带，与假手术组比较，有明显差异(P＜0.01);与缺血组比较，预处理组TNF-α的表达量明显降低(P＜0.01)。见图2和表1。

图1 3组大鼠脑组织TLR4蛋白的表达(SP，×400)

图2 3组大鼠脑组织TNF-α蛋白的表达(SP，×400)

表1 各组TLR4和TNF-α阳性表达率的比较(x ± s，n=8)

3 讨论

脑梗死后，坏死及缺血区域因急性缺血而触发炎性瀑布反应，导致过度的炎性损伤，成为神经元死亡的重要机制之一〔5〕。研究表明，小胶质细胞数量的增加与缺血再灌注后脑损伤的程度呈正相关，即小胶质细胞的过度活化加重了缺血后脑损伤的发生〔6〕。

TLRs是一个介导天然免疫的古老家族，迄今为止至少有10种TLRs类型，其中对TLR4的研究最广泛。TLR4在人和鼠脑中均有大量的表达，主要分布在小胶质细胞。研究表明，在炎症损伤的过程中小胶质细胞是损伤递质的主要来源，TLR4在诱导中枢神经损伤中发挥着关键作用〔7〕。TLR-4介导的信号转导途径包括髓样分化蛋白88(Myd88)依赖性和非依赖性，激活后将信号传递至NF-κB，引起TNF-α、白介素、干扰素-β等炎性因子的瀑链式激活而产生生物学效应〔8，9〕。Cao 等〔10〕研究发现，脑缺血再灌注后TLR4缺陷的大鼠通过抑制小胶质细胞的激活，下调炎性细胞因子的产生来减少炎症反应。

本实验显示头孢曲松钠可以显著降低大鼠缺血脑组织中TLR4的表达水平，推测头孢曲松钠可能通过TLR4及其信号传导通路抑制炎症反应的发生。

TNF-α是重要的促炎反应介质，主要来源于活化的胶质细胞，特别是小胶质细胞，具有复杂的生物学活性〔11〕。目前认为，TNF-α介导了脑梗死后引起的炎性损伤〔12〕。目前认为，脑内TNF-α主要通过3条途径加剧炎症反应和神经细胞的损伤:①激活NF-κB途径，导致炎性因子的大量表达，从而启动炎症级联反应，加重神经损伤;②促进内皮细胞与白细胞黏附分子的表达，引起血管炎症反应，增加了血管对外周炎症细胞的通透性，从而加重脑缺血及脑水肿;③细胞内NO合酶的表达增加。

本实验表明TNF-α参与了脑缺血炎性损伤过程。CTX通过抑制缺血后TNF-α的表达，减轻神经炎性反应。本实验观察到，对照组及头孢曲松预处理组的对侧皮质中均有TNF-α蛋白的表达，但表达量均小于缺血侧。但在缺血对侧的皮层中，TLR4的表达无明显增加，但不能完全说明缺血对侧的TNF-α可能与TLR4的激活无关，也可能与样本量小有关，需进一步探讨。

本文提示TLR4和TNF-α参与了缺血性脑损伤的炎性反应过程，头孢曲松预处理具有抑制缺血后脑组织TLR4和TNF-α表达的作用，通过抑制损伤后炎症反应发挥神经保护作用。但TLR4如何被激活，以及信号传导过程有待于进一步研究。

1 Yang J，Ding JW，Chen LH，et al.Sequential expression of TLR4 and its effects on the myocardium of rats with myocardial ischemia-reperfusion in-jury〔J〕.Inflammation，2008;31:304-12.

2 Thöne-Reineke C，Neumann C，Namsolleck P，et al.The beta-lactam antibiotic，ceftriaxone，dramatically improves survival，increases glutamate uptake and induces neurotrophins in stroke〔J〕.Hypertension，2008;26(12):2426-35.

3 陈佳俊，石岩殊，韩雪梅，等.线拴法大鼠局灶性脑缺血模型(PMCAO)的实验研究〔J〕.吉林医学，2004;25(10):16-7.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

5 Denes A，Thornton P，Rothwell NJ，et al.Inflammation and brain injury:acute cerebral ischaemia，peripheral and central inflammation〔J〕.Brain Behav Immun，2010;24(5):708-23.

6 韩书珍，王 果，李泽宜，等.CLSM观察大鼠局灶性脑缺血半暗区小胶质细胞的变化及意义〔J〕.中风与神经疾病杂志，2010;5(27):399-403.

7 Laflamme N，Echchannaoui H，Landmann R，et al.Cooperation between Toll-like receptor 2 and 4 in the brain ofmice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria〔J〕.Eur J Immunol，2003;33(8):1127-38.

8 Wang H，Li ZY，Wu HS，et al.Endogenous danger signals trigger hepatic ischemia/reperfusion injury throngh toll-like recepter4/nuclear factorkappa β pathway〔J〕.Chin Med JEngl，2007;120(6):509-14.

9 Rowe DC，McGettrick AF，Latz E，et al.The myristoylation of TRIF-related adaptor molecule is essential for Toll-like receptor 4 signal transduction〔J〕.Proc Natl ACAD Sci USA，2006;103(16):6299-304.

10 Cao CX，Yang QW，Lv FL，et al.Reduced cerebral ischemia-reperfusion injury in Toll like receptor 4 deficient mice〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;353(2):509-14.

11 Sergeeva SP，Erofeeva LM，Gultiaev MM.IL-1beta，IL-10，INF-gamma，TNF-alpha，S100beta，AMA-M2 and cell immune response in stroke〔J〕.Patol Fiziol Eksp Ter，2011;3(1):41-5.

12 Munshi A，Rajeshwar K，Kaul S，et al.Association of tumor necrosis factor-α and matrix metalloproteinase-3 gene variants with stroke〔J〕.Eur J Neurol，2011;18(8):1053-9.