阿霉素心肌病大鼠死亡结构域相关蛋白mRNA表达及黄芪甲甙的干预作用

钟 飞 周卫华 石慧娟 张 洁

(吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

心肌细胞凋亡是在一定生理和病理条件下，通过特殊信号转导途径，激活细胞“自杀”程序，在基因调控下进行的程序化死亡。目前认为心肌细胞凋亡是心血管疾病发生发展的细胞学基础，在心肌病的发生发展过程中起重要作用〔1〕。死亡结构域相关蛋白(Daxx)是Yang等〔2〕在1997年发现的一种Fas死亡结构域结合蛋白，可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路诱导细胞凋亡;研究显示，干预Daxx在心肌中的表达，可减少大鼠心肌梗死的面积与心肌细胞的凋亡〔3〕，我们推测Daxx可能成为调节细胞凋亡新的重要药理作用靶点，我们以前的研究表明黄芪甲甙具有减少阿霉素性心肌病心肌细胞凋亡作用，本研究在前期工作的基础上，进一步探讨黄芪甲甙调控心肌细胞凋亡的作用机制，为开发研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠40只，SPF级，体重200～250 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

1.2 实验试剂与材料 黄芪甲甙(成都锦泰和医药化学技术有限公司)用助溶剂羧甲基纤维素钠制成所需浓度，DEPC(Sigma公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(Promega公司)，氯仿(国药集团化学试剂公司)，异丙醇(国药集团化学试剂公司)，琼脂糖(Sigma公司)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要实验仪器 TGL-16G冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂生产);723可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);莱卡切片机(RM2126);全自动生物组织脱水机(YD-12G);生物组织包埋机(YD-6L);DYY-Ⅲ稳压稳流电泳仪(北京六一厂)，DYCZ水平电泳槽(北京六一厂)，天能1600R凝胶成像分析系统。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组及干预方法 大鼠随机分为4组，即正常组、模型组、黄芪甲甙高剂量组，黄芪甲甙低剂量组，每组10只。正常组采用生理盐水0.6 ml腹腔注射，隔日1次，共6次，同时用1%羧甲基纤维素钠1 ml，每天1次灌胃。模型组采用阿霉素造模〔4〕(2.5 mg/kg，隔日 1次腹腔注射，共 6次，总剂量为15 mg/kg);同时灌胃给予1%羧甲基纤维素钠1 ml，每天1次。黄芪甲甙处理组造模方法同模型组，高低剂量组同时分别灌胃给予黄芪甲甙90 mg/kg和30 mg/kg〔5〕(用1 ml 1%甲基纤维素钠溶解)，每天1次灌胃，连续2 w，最后一次阿霉素处理24 h后，用20%乌拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，摘取心脏取血，心脏沿左心室中线切为两半，一半用甲醛固定，石蜡包埋后作病理组织学检查。

1.4.2 心肌病理学检测 大鼠心肌10%的甲醛固定24 h，常规脱水透明，石蜡包埋，切片，片厚5μm，HE染色，200倍光镜下观察心肌病理改变，并根据Kishimoto方法〔6〕计算心肌病变积分，即每张切片随机取5个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比，无病变计0分，病变面积 ＜25% 计1分，25% ～ 50%计2分，50% ～75%计3分，＞75%计4分。

1.4.3 血清ALT和AST的活性测定 最后一次阿霉素处理24 h后，用20%的乌拉坦麻醉大鼠，心脏取血，3 500 r/min离心15 min，取上清，严格按试剂盒说明书进行操作，测定血清CK和LDH活性。

1.4.4 RT-PCR检测Daxx表达 取心肌20 mg剪碎，采用Trizol试剂1 000μl一步法提取心肌总RNA，应用UV-3100型紫外光光度计检测样品吸光度A，A260/A280为1.8～2.0。应用RT-PCR法检测大鼠心肌组织的Daxx mRNA的表达。Daxx上游引物:5'-TCCAACCCAGCCTCTAATCC-3'，下游引物:5'-TAGCCCTCCCAGTATCTCGT-3'，β-actin 上 游 引 物:5'-ATGTGCAAAGCCGGCTTC-3'，β-actin 下游引物 5'-GGCTGGGGTGTTGAAGGTCT-3'，反应条件为:94℃变性 50 s，58℃ 退火 40s，72℃延伸60 s。反应产物用1% 琼脂糖凝胶电泳(100 V，40 min)，紫外灯下观察结果并摄片，用凝胶成像分析系统扫描，进行图像分析，吸光面积积分比值表示DNA含量，以Daxx与β-actin扩增条带的吸光面积积分比值评定Daxx mRNA表达水平。

1.5 统计学方法 所有计量数据采用x±s表示，采用SPSS16.0统计软件进行分析，组间比较用方差分析，两两比较用S-N-K法。

2 结果

2.1 黄芪甲甙对阿霉素大鼠心肌组织病理的影响 对照组心肌细胞排列整齐，胞核清晰，无心肌纤维的破坏，细胞间隙正常，未见水肿，组织间隙无炎性渗出。模型组心肌细胞肿胀，排列紊乱，心肌纤维减少，肌原纤维断裂，多灶性变性和坏死，心肌坏死灶内可见单核、淋巴细胞浸润。高剂量组和低剂量处理组上述病变明显减轻，尤以高剂量组最为明显，心肌细胞变性坏死显著减少，肌原纤维排列较整齐，心肌间仅见部分红细胞浸润。高剂量干预组和低剂量干预组心肌病理积分明显低于模型对照组(P＜0.05)。见图1和表1。

2.2 心肌生化指标 模型组大鼠心肌组织LDH和CK活性升高，与正常组相比有统计学意义(P＜0.05);灌胃给予高低不同剂量黄芪甲甙后，大鼠心肌组织LDH和CK活性下降，与模型组相比有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 RT-PCR检测Daxx表达 与正常组相比，模型组大鼠心肌组织Daxx mRNA增加至正常水平的(1.65±0.22)倍(P＜0.01)，黄芪甲甙低剂量和高剂量灌胃给药后大鼠心肌组织中daxx的表达分别为正常水平的(1.19±0.10)和(1.48±0.12)倍，与模型组相比显著性差异(P＜0.05)。见图2。

图1 黄芪甲甙对阿霉素大鼠心肌组织病理的影响(HE染色，×400)

表1 黄芪甲甙对大鼠心肌组织病理积分，LDH和CK活性的影响(x ± s，n=10)

图2 心肌组织中Daxx表达水平的变化

3 讨论

普遍认为阿霉素诱导的心肌损伤与过量氧自由基的产生有关〔7〕，它导致细胞膜脂质过氧化，导致细胞膜的直接损害〔7〕，导致CK和LDH的含量升高。黄芪甲甙为中药黄芪的重要的活性成分，研究表明其对病毒性心肌炎具有良好的治疗效果，能改善病毒性心肌病大鼠心功能、减轻心肌病理改变〔8，9〕。我们以前的研究证实黄芪甲甙可以显著减少阿霉素所诱导的心肌细胞凋亡〔10〕。本实验病理结果分析表明黄芪甲甙可显著减轻阿霉素心肌病大鼠的心肌病理损害，降低其血清CK和LDH活性，保护心肌细胞，从而治疗阿霉素心肌病。

近年来的研究证实ADR导致心肌细胞凋亡在其对心肌的毒性损伤机制中起重要的作用〔10〕。Fas为死亡受体，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员。FasL为死亡因子，是Fas的天然配体，当表达Fas的靶细胞和活性细胞的FasL交联后，启动凋亡信号传导途径，从而激活Fas/FasL途径下游的ICE相关蛋白酶系列，引起核酸内切酶活化，降解DNA修复酶及细胞骨架调节蛋白，最终导致Fas表达阳性的靶细胞凋亡〔11〕。Fas/FasL系统介导的凋亡信号传导途径是许多心血管疾病发生发展的重要机制〔12〕。研究首先证实Daxx在氧化应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用，H2O2处理细胞能诱导Daxx表达上调，而用反义寡核苷酸抑制Daxx的表达能抑制H2O2诱导的细胞凋亡。Yaniv等〔13〕研究进一步探明了Daxx诱导细胞凋亡的作用机制，首先H2O2激活Fas，Fas的死亡结构域 DD区可与Daxx的C末端一个功能区结合，通过激活JNK途径而启动凋亡的发生。我们的实验结果表明，Daxx在阿霉素心肌病大鼠心肌中表达升高，表明Daxx可能通过Fas-Daxx-JNK介导了阿霉素诱导的细胞凋亡。

综上所述Daxx在阿霉素心肌病大鼠心肌中表达上调，并在阿霉素心肌病的发生发展中起一定的作用，黄芪甲甙能下调Daxx的表达，减轻病理损害，其机制可能与抑制细胞凋亡等保护心肌细胞等作用有关。

1 Yamaguchi S，Yamaoka M，Okuyama M，et al.Elevated circulating levels and cardiac secretion of soluble Fas ligand in patients with congestive heart failure〔J〕.Am J Cardiol，1999;83(10):1500-3，A1508.

2 Yang X，Khosravi-Far R，Chang HY，et al.Daxx，a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis〔J〕.Cell，1997;89(7):1067-76.

3 Roubille F，Combes S，Leal-Sanchez J，et al.Myocardial expression of a dominant-negative form of Daxx decreases infarct size and attenuates apoptosis in an in vivo mouse model of ischemia/reperfusion injury〔J〕.Circulation，2007;116(23):2709-17.

4 Siveski-Iliskovic N，Hill M，Chow DA，et al.Probucol protects against adriamycin cardiomyopathy without interfering with its antitumor effect〔J〕.Circulation，1995;91(1):10-5.

5 李 丽，陶辉宇，陈杰斌，等.黄芪甲甙保护阿霉素心肌损伤大鼠抗凋亡作用的机制研究〔J〕.中国中西医结合杂志，2006;26(11):1011-4.

6 Kishimoto C，Kawamata H，Sakai S，et al.Enhanced production of macrophage inflammatory protein 2(MIP-2)by in vitro and in vivo infections with encephalomyocarditis virus and modulation of myocarditis with an antibody against MIP-2〔J〕.JVirol，2001;75(3):1294-300.

7 戚本玲，刘洪智，曹林生，等.缬沙坦对阿霉素心肌病大鼠的心脏保护作用及机制研究〔J〕.中国病理生理杂志，2007;23(4):689-92.

8 李炜莉.端粒酶在阿霉素性心肌病发病机制的作用及黄芪甲甙干预的研究〔D〕.衡阳:南华大学，2008.

9 罗永姣，刘红英，李双杰.小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎心脏炎症细胞因子基因和蛋白表达及黄芪甲甙干预研究〔J〕.中国动脉硬化杂志，2009;17(2):122-4.

10 钟 飞，李 辉，周卫华.黄芪甲甙对大鼠阿霉素心肌细胞凋亡的影响〔J〕.吉首大学学报(自然科学版)，2008;29(6):104-6.

11 周丽华.Fas/FasL系统与心肌细胞凋亡〔J〕.中国地方病学杂志，2003;22(4):370-2.

12 Hou XW，Son J，Wang Y，et al.Granulocyte colony-stimulating factor reduces cardiomyocyte apoptosis and improves cardiac function in adriamycin-induced cardiomyopathy in rats〔J〕.Cardiovasc Drugs Ther，2006;20(2):85-91.

13 Yaniv G，Shilkrut M，Larisch S，et al.Hydrogen peroxide predisposes neonatal rat ventricular myocytes to Fas-mediated apoptosis〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2005;336(3):740-6.