寻常性银屑病患者外周血和皮损中Thl7细胞表达及相关性研究

邓俊峰罗志广黄俊青杨国良

1.深圳宝安石岩人民医院，广东深圳518108;2.深圳市宝安区西乡人民医院，广东深圳518108

寻常性银屑病俗称牛皮癣，是一种常见的具有特征性皮损的慢性易于复发的皮肤病。该病顽固难治，是当今世界皮肤科领域的重要研究课题，是全世界皮肤科重点防治疾病之一。目前Th17细胞在银屑病发病过程中的作用越来越引起人们的重视，研究认为Th17细胞及相关因子IL-17、IL-22表达与寻常性银屑病患者疾病严重程度相关[1]。该研究旨在探讨寻常性银屑病患者外周血和皮损中Th17细胞及相关因子IL-17、IL-22表达，选取2012年1月—2012年12月该院收治的127例银屑病患者分成两组，门诊就医确诊的银屑病患者78例为实验组，另选取门诊和住院外科手术患者48例无银屑病等免疫相关性疾病为对照组，分析其与疾病严重程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验组：参照1991年10月中国中西医结合学会皮肤性病学会颁布的寻常性银屑病诊断标准，遴选病例。对照组：所选病例近1个月未作局部治疗，2个月内未作任何免疫抑制剂治疗，无其他免疫性皮肤病及系统性疾病，观察前1个月内无细菌、真菌、病毒感染，既往无银屑病等免疫相关皮肤疾病。

1.2 研究对象

选取该门诊就医确诊的银屑病患者78例为实验组，男49例，女29例，年龄24～65岁，平均43岁，病程4个月～22年，平均8.5年，PASI[2]评分22～60.6分。另外选取门诊和住院外科手术患者48例(无银屑病等免疫相关性疾病)为对照组，男29例，女19例，年龄25～63岁，平均44岁。

1.3 主要试剂

兔抗CD4、兔抗IL-17（北京中杉金桥公司），量子点双染荧光试剂盒（武汉珈源量子点技术有限公司）,流式抗体藻红蛋白一青色素染料5(PE-cy5)抗人CD3，FITC抗人CD8，藻红蛋白(PE)抗人 IL一 17A，PE鼠IgG同型对照（美国 eBioscience公司）,佛波酯肉豆蔻酸乙酸盐(PMA)、莫能星钠盐、伊屋诺霉素钙盐购自美国 Sigma公司，FIX&PERM（联科生物科技有限公司），IL-17、IL-22ELISA试剂盒（联科生物科技有限公司），多光谱成像仪（Nuance美国剑桥仪器公司），FACSCalibur型流式细胞仪 （美国BD公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 组织中Th17细胞的表达 收集实验组患者典型皮损组织和对照组正常皮肤组织。所取组织常规石蜡包埋，切片厚度3 μm，切片脱蜡水化，微波抗原修复，滴加稀释的CD4一抗，37℃湿盒孵育 2 h。加吐温 20的 Tris缓冲盐水(TBs-T)洗涤(3×5 min)，滴加缓冲液，37℃湿盒孵育封闭10 min；滴加稀释的生物素化IgG，37℃湿盒孵育30 min；缓冲液封闭20 min；滴加稀释的量子点标记的链酶亲和素复合物 (QDs-SA)，37℃湿盒孵育30 min；TBS-T洗涤(3×5 min)，滴加缓冲液。37℃湿盒孵育封闭10 min；滴加稀释的IL-17一抗，4℃过夜。TBS-T洗涤(3×5 min)，滴加缓冲液，37℃湿盒孵育封闭20 min；滴加稀释的量子点标记的免疫球蛋白 G 复合(QDs-IgG)，37℃湿盒孵育 30 min；TBS-T 洗涤(3×5 min)，Tris缓冲盐水(TBS)洗涤(2×5 min)。缓冲甘油封片，荧光显微镜下紫外光激发观察成像,多光谱分析仪分析结果存盘。QDs-SA波长605 nm，发红光，QDs-IgG波长525 nm，发绿光。红色信号为CD4，绿色信号为IL-17+，黄色区域CD4+IL-17+即为Th17细胞。

1.4.2 Th17细胞流式细胞仪计数 采集实验组和对照组静脉血2 mL，肝素钠抗凝，24 h内检测。取1只试管加入150 μL血液和150 μL RPMI1640细胞培养基，加入LPMA工作液、伊屋诺霉素工作液和莫能星工作液，混匀，37℃、5%C02培养箱培养4 h，进行破膜和胞内细胞因子染色，用流式细胞仪测定细胞荧光抗体染色阳性率，即CD4+CD8-IL-17+细胞群所占的百分比。

1.4.3 血清中IL-17、IL-22的检测 采集银屑病患者和正常人对照者静脉血3 mL，静置留取血清500 μL，置于-20℃保存待检。按照ELISA检测试剂盒说明进行，酶标仪读取A值。

1.5 统计方法

使用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，检测结果以（±s）表示，采用χ2检验、Wilcoxon秩和检验和Spearman相关分析等统计学方法。

2 结果

2.1 组织中Th17细胞表达比例

实验组患者组织中Th17细胞表达比例为(3.1±1.0)%，对照组为(0.4±0.2)%,两组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 寻常型银屑病患者Th17细胞中的CD4及IL-17抗体表达阳性率比较

实验组患者CD4及IL-17抗体阳性表达率为(2.9±1.1)%，对照组为(0.5±0.4)%,两组相比差异有统计学意义（P<0.05）。银屑病患者Th17细胞中的CD4及IL-17抗体表达阳性率与PASI无相关性(r=0.321,P>0.05)。

2.3 银屑病患者外周血中IL-17和IL-23水平比较

实验组患者外周血IL-17和IL-23表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，并与 PASI呈正相关(r=0.501,P<0.05)，见表 1。

表1 银屑病患者外周血中IL-17和IL-23水平比较

3 讨论

银屑病是皮肤科最为常见的一种慢性的具有特征性皮损的炎症性皮肤病，皮损可仅仅发生在身体的某一个部位，也可以遍布全身各处。表现为红色的丘疹、红斑或大小不等的扁平斑块[2-3]。上面覆盖着厚薄不等、容易脱落的银白色鳞屑。把鳞屑刮挂去后，可见到一层光滑的红色薄膜，再把薄膜揭去，即可见到一些细如针尖的出血点。这种红色薄膜和点状出血的现象，是寻常型银屑病的重要特征[4]。且银屑病还具有复发性和持续性，这对患者的身心健康和生活质量造成了严重的影响，中国医学科学院皮肤病研究所对皮肤病作了大量研究，结果表明银屑病在皮肤科门诊总量中占有较大的比例[5-6]，且患病人数逐年增加，但目前尚没有能根治银屑病有效治疗手段，所以新的治疗方法和治疗药物急需解决。

研究证明,在银屑病的发生发展全过程中免疫细胞和炎症因子起到了重要作用[3]，该研究发现寻常性银屑病患者外周血和皮损中Thl7细胞及相关因子IL-17、IL--22表达与疾病严重程度呈正相关，提示银屑病患者外周血IL-17和IL-23高表达,可能是银屑病免疫发病机制中的重要环节。因此该研究认为可以通过对IL-23/Th17细胞通路进行干预，而找到诊断和治疗寻常性银屑病的新途径和新药物。这将对治疗寻常性银屑病有很大帮助。

[1] TesmerLA，LundySK，Ssl-kalrS，et al.Thl7 cellsin humandisease[J].Immunol Rev，2008，223：87，113.

[2] 张长宋，赵天恩，陈树民.银屑病病情严重程度评判指标的研究现状[J].国外医学（皮肤性病学分册），2002，28(2)：82，84.

[3] 陈永锋,常树霞,郑道城.寻常性银屑病患者外周血和皮损中Th17细胞及相关因子的表达[J].中华皮肤科杂志,2011，44（1）：11-14.

[4] YawalkarN,TscharnerGG,Hunger RE,et al.Increased expression of IL-12p70 and IL-23 bymultiple dendritic cell and macrophage subsets in plaque psoriasis[J].J Dermatol Sci,2009,54(2):99-105.

[5] 韩凤娴,徐丽敏,赵宏丽,等.流式细胞分析法测定外周血皮肤淋巴细胞相关抗原阳性T细胞在寻常性银屑病中的表达[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2008，7（3）：158-159.

[6] 顾宁琰,陈敏,崔盘根,等.寻常性银屑病患者外周血单一核细胞IFN-γ受体和TNF-α受体mRNA表达的研究 [J].中华皮肤科杂志,2009，42（7）：473-476.