Pv MSP1－19重组蛋白体外对间日疟患者外周血T细胞免疫功能的影响

李光友，夏 惠，陶志勇，陈 勇，方 强

2.安徽省芜湖市第二人民医院检验科，芜湖 241001

疟疾是严重危害人类健康的寄生虫病之一。据世界卫生组织2009年全球疟疾报告，全球有约2.5亿人发病，近90万人因疟疾感染而死亡。由于疟疾红细胞内期疫苗能通过抑制裂殖子侵入红细胞，降低疟原虫密度，从而能减少间日疟的临床发病，同时也起到间接抑制疟疾传播的作用［1］。疟原虫裂殖子表面蛋白1（Merozoite surface protein 1，MSP－1）是一种表达于裂殖子表面的蛋白，参与裂殖子对红细胞的入侵。重组MSP1－19与自然感染间日疟原虫患者的血清具有很强的免疫反应性［2］。因此其作为疟疾防治的重要疫苗候选分子引人关注。据此，本文用纯化的MSP1－19重组蛋白刺激间日疟既往感染者外周血T细胞，以分析其对T细胞的免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象 安徽北部地区半年内间日疟既往感染者11例，年龄20～70岁（平均45岁），其中男性5例，女性6例。所选间日疟既往感染者均排除肝炎与结核病史。

1.2 主要试剂和设备 淋巴细胞分离液购自天津TBD生物技术公司，重组人白细胞介素－2（IL－2）购自长春长生基因药业公司，新生小牛血清购自杭州四季青生物公司，RPMI 1640购自美国GIBCO公司，荧光抗体IFN－γ－FITC，IL－4－PE，CD4－PeCy5.5，CD3－APC购自美国Caltag Laboratories公司，莫能霉素（Monensin，Mo）购自美国 Sigma－Aldrich公司，CFSE购自美国Molecular Probes公司，流式细胞仪FACSCalibur购自美国BD公司，纯化的PvMSP1－19重组蛋白系本室自制。

1.3 方法

1.3.1PvMSP1－19重组蛋白体外刺激间日疟既往感染者T细胞分泌细胞因子效应的分析 取间日疟既往感染者肝素抗凝血，按常规方法分离单个核细胞，用含10%NBS的RPMI 1640培养液调淋巴细胞浓度为1×106/m L，按每孔1 m L加入24孔培养板，分别加入纯化的PvMSP1－19重组蛋白5μg和IL－2 50 U，同时设置单独加IL－2的对照组，每3～4 d补加50 U IL－2以维持细胞生长，培养至第7 d时收获细胞。

1.3.2 CFSE标记法分析PvMSP1－19刺激T淋巴细胞增殖效应的分析 用RPMI 1640将淋巴细胞调制成1×106/m L细胞悬液。加入CFSE至终浓度为1μmol/L，置37℃水浴箱孵育10 min后，用含10%NBS的RPMI 1640培养液洗3次。再用含10%NBS的RPMI 1640培养液调淋巴细胞浓度为1×106/m L，按每孔1 m L加入24培养板，分别加入纯化的PvMSP1－19重组蛋白5μg和IL－2 50U，同时设置单加IL－2对照组，每3～4 d分孔传代并补加IL－2 50 U以维持细胞生长，培养至第7 d收获细胞。

1.3.3 T细胞分泌细胞因子的流式细胞仪分析收集培养第7 d的淋巴细胞，再用含10%NBS的RPMI 1640培养液调浓度为1×106/m L，在刺激组中再加入纯化的PvMSP1－19重组蛋白5μg，37℃、5%CO2环境下刺激培养24 h，在培养最后4 h时加入终浓度为2.5μmol/L的Mo以阻断细胞因子的分泌，同时设置不加PvMSP1－19重组蛋白的对照组。收集再刺激培养后的细胞，加入CD4－PeCy 5.5、CD3－APC，4℃避光反应30 min，染色缓冲液（staining buffer，SB）洗两次，用2% 多聚甲醛（PFA）4℃固定30 min，SB洗两次，透膜缓冲液（PBS－10%NBS－0.1%皂素 ）4℃避光透膜15 min，加入终浓度为5%的牛血清白蛋白（BSA）和10%的小鼠血清，4℃避光封闭30 min，加入IL－4 PE、IFN－γ－FITC和相对应的同型对照荧光抗体，4℃避光反应30 min，透膜缓冲液洗两次，SB洗一次，2%PFA 200μL重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，每一测定管均检测和获取10万个细胞。

1.4 统计学分析 数据处理采用spss16.0统计软件，数据以均数χ2标准差表示。比较刺激组与未刺激组的差异采用双样本t检验；P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1PvMSP1－19重组蛋白刺激间日疟既往感染者外周血T细胞分泌细胞因子效应的分析 经PvMSP1－19重组蛋白刺激扩增后的T细胞进行流式细胞仪分析，与PvMSP1－19重组蛋白未刺激组（3.46%）比较，CD8＋T 细胞分泌IL－4的百分率在刺激组（8.04%）明显升高（P＜0.05），而IFN－γ的分泌两组（0.82%，1.05%）间并无差异（P＞0.05）。分泌IL－4和IFN－γ单阳性CD4＋T细胞的百分率在刺激组（1.81%，0.19%）与未刺激组（1.89%，0.05%）之间均并无明显差异（P＞0.05）。图1所示为某一典型个体CD8＋和CD4＋T细胞分泌IL－4和IFN－γ情况。

2.2PvMSP1－19重组蛋白刺激间日疟既往感染者外周血细胞增殖水平的分析 用Modfit软件分析刺激扩增后刺激组与未刺激组淋巴细胞增殖动力模型，计算各组淋巴细胞增殖指数（PI），PvMSP1－19重组蛋白刺激组CD8＋T细胞增殖指数PI（5.65%）明显高于未刺激组（3.69%，P＜0.05），而CD4＋T细胞增殖指数PI在两组（1.74%，1.78%）间无差异（P＞0.05）。图2所示为某典型个体CD8＋T细胞和CD4＋T细胞增殖指数PI。

图1 Pv MSP1－19抗原刺激间日疟既往感染者PBMC后CD8＋和CD4＋T细胞分泌IL－4和IFN－γ的情况注：A.同型对照；B.刺激组；C.未刺激组Fig.1 The percentage of IL－4 and IFN－γCD4＋ and CD8＋ cells of PBMC stimulated with Pv MSP1－19 antigenA：Isotype control；B：Stimulated group；C：Unstimulated group

图2 Pv MSP1－19抗原激活间日疟既往感染者PBMC后CD4＋和CD8＋T细胞增殖情况注：A.刺激组；B.未刺激组Fig.2 Proliferation of CD4＋ and CD8＋T cells from PBMC stimulated with Pv MSP1－19 antigenA：Stimulated group；B：Unstimulated group

3 讨 论

抗体和CD4＋T细胞在抗红内期疟原虫感染中发挥重要的作用，而对于CD8＋T细胞的保护作用尚存在争议［3－7］。近期众多研究发现 CD8＋T细胞在疟疾红内期也可产生保护性免疫应答，并可通过释放一些细胞因子使脾脏的巨噬细胞活化，从而有助于红内期疟原虫的清除［8－10］。

免疫记忆性是机体对外界致病原最有效的抵抗机制，可保证机体再次遇到同一致病原时迅速启动免疫防御机制，消灭病原体，是疫苗作用的物质基础。本实验利用PvMSP1－19重组蛋白刺激间日疟既往感染者外周血淋巴细胞，通过流式细胞仪检测CD4＋T细胞及CD8＋T细胞的增殖和分泌细胞因子的情况，可反映既往感染者体内可能存在的记忆性T细胞的类别和这些记忆性T细胞可能通过释放何种细胞因子来发挥免疫防御作用。实验结果显示，CD8＋T细胞在PvMSP1－19重组蛋白刺激7d后发生显著活化增殖，而CD4＋T细胞的增殖不明显。Jangpatarapongsa等对间日疟现症感染者发病时、抗疟治疗后14 d、28 d及60 d时外周血两种早期记忆性T细胞进行了动态观察，结果也显示，早期CD4＋记忆性T细胞随着时间推移，呈下降趋势，但早期CD8＋记忆性T细胞在随访期间保持在较稳定水平［11］。

已知CD8＋T细胞除直接杀伤靶细胞外，根据分泌细胞因子不同可分为Tc1和Tc2两大亚群，其中Tc1细胞主要分泌IFN－γ，Tc2细胞主要分泌IL－4。本试验表明在间日疟既往感染者的外周血内存在一定数量针对PvMSP1－19重组蛋白的记忆性CD8＋T细胞（Tc2），这些CD8＋T细胞通过分泌IL－4发挥免疫防御作用。后者可促进B细胞的增殖、分化和特异性抗体的产生。同时IL－4可诱导嗜酸性粒细胞活化，在抗寄生虫感染中发挥着重要作用。而记忆CD8＋T细胞的产生与维持也受到IL－4的调节，体外CD8＋T细胞与IL－4共培养后转移至正常鼠体内可分化为长效记忆细胞［12］，IL－4还可能提供防止凋亡的信号、诱导细胞向记忆性亚类分化［13］。

综上所述，PvMSP1－19重组蛋白在体外能刺激间日疟既往感染者外周血CD8＋T细胞显著增殖活化，后者通过分泌IL－4而发挥免疫调节作用，这将为PvMSP1－19疫苗的研制和开发提供一定的理论基础。

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