p TWIN1－EgAgB8/3自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达

张瑞妮，吾拉木·马木提，于春洋，法蒂玛·木特力甫

细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus）感染狗等犬科动物是人体囊型包虫病的主要传染源，因此犬感染细粒棘球绦虫情况的动态监测、合理驱虫治疗是预防和防制包虫病流行的关键性措施之一，而筛选具有较高特异性的有效抗原成分是运用粪抗原检测方法快速诊断棘球绦虫感染犬的重要前提。抗原B（AgB）是包虫囊液中主要的分泌性抗原成分，由一组大小约8 k D左右的同源性较高的亚单位（抗原B 8k D亚单位）聚合形成的分子量为120～160 k Da的耐热性多聚蛋白，并被认为是目前用于包虫病免疫学诊断中具有较高敏感性和特异性的抗原之一。现已发现抗原B 8 k D亚单位由AgB8/1、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4、AgB8/5等5个基因表达［1－3］。Mamuti等［4－6］研 究 发 现 细 粒 棘 球 绦 虫 的AgB8/3（Eg AgB8/3）在棘球绦虫成虫阶段出现大量表达现象。且Eg AgB8/3是虫体分泌性蛋白，可随感染犬的粪便排出体外，易于被检测，有望成为ELISA夹心法诊断棘球绦虫感染犬粪抗原检测的候选靶蛋白。为此，陈洁等［7］利用 Trx－Eg AgB8/3重组蛋白制备多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性，但还是与9%的犬复孔绦虫自然感染犬粪出现了交叉反应，这很可能归因于融合表达的TRx造成的非特异性交叉反应，为克服交叉反应，本研究应用融合标签自剪功能的表达载体p TWIN1对Eg AgB8/3进行了表达纯化并鉴定其生物学活性。通过几丁质柱将融合蛋白的纯化和融合标签自剪切一步完成并可自动释放目的蛋白r Eg AgB8/3多肽，无需借助外源蛋白酶，从而节省了时间和成本，并为后续具有较高特异性抗体的制备和运用粪抗原检测方法诊断棘球绦虫感染犬奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 种 与 质 粒 p ET32a－Eg AgB8/3－E.coliBL21（DE3）LysS原核表达系统为新疆医科大学基础医学院寄生虫教研室保存，克隆质粒p EASY－T1和原核表达纯化载体系统IMPACTTM－TWIN分别购自Transgene和NBA公司，大肠杆菌E.coliDH5α和E.coliB ER2566分别购自Transgene和NBA公司。

1.1.2 主要试剂 胶回收试剂盒（Bioteke公司），PCR试剂盒（Takara公司），质粒小量抽提试剂盒（OMEGA公司），抗CBD抗血清、无填料层析柱、彩色预染蛋白Ladder、DTT（北京NBA公司），PVDF膜，WesternBreeze试剂盒（Invitrogen公司）。

1.1.3 主要仪器 MyCycler PCR仪（Bio－Rad公司），电泳仪、凝胶成像仪（Bio－Rad公司），HC－3018高速冷冻离心机（科大创新股份公司）。

1.1.4 引物设计与合成 细粒棘球蚴Eg AgB8/3基因序列（GenBank登录号为AF362442），利用DNAman软件设计引物，在上游引物P1的5′端添加GGT保护性碱基和限制性内切酶EcoR I酶切位点，下游引物P2的5′端加GGT保护性碱基和限制性内切酶BamH I酶切位点，P1：5′－GGTGAATTCGATGATGATGATGA －TGAA－3′，P2：5′－GGTGGATCCCTACTCATCCTCTTTAAC－3′。 表 达 载 体p TWIN1测序鉴定引物设计，距酶切位点EcoR I上游80 bp与BamH I下游80 bp处设计两引物，及 F：5′－TTTTTGATTTGACTGTGCCA－3′R：5′－CAAAAAACCCCTCAAGA －CCC－3′，引物由上海Sangon公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Eg AgB8/3基因分泌型多肽片段核酸序列的扩增将－80℃冻存的p ET32a－Eg AgB8/3－E.coliBL21（DE3）LysS解冻后取50μL置于EP管中，95℃煮沸10min，8 000 r/min离心15 min，收集上清。以上清为模板DNA，加入特异性引物P1、P2，PCR扩增Eg AgB8/3编码分泌型多肽的基因片段。（1）反应体系：PCR mix Buffer 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 2μL，灭菌超纯水补足至总体积20μL。（2）扩增条件：95℃6 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃延长10 min。（3）扩增产物回收：PCR产物目的条带的切胶回收按DNA凝胶回收试剂盒说明书操作。

1.2.2 pEASY－T1－Eg AgB8/3重组质粒的构建和鉴定 将上述胶回收的PCR扩增产物与p EASY－T1载体连接，连接体系为10μL；目的基因片段PCR产物4μL，pEASY－T1 vector 1μL，SolutionI 5μL，25℃孵育10 min后将连接产物转化至Trans1－T1感受态细胞，涂布于预先用异丙基硫代半乳糖苷和X－Gal处理的氨苄青霉素LB平板上，同时设空质粒阳性对照及空白板阴性对照。根据蓝白斑筛选原理，从转化平板上挑取白色单菌落，220 r/min，37℃摇菌过夜。利用质粒提取试剂盒提取质粒，用PCR扩增目的片段和EcoR I、BamH I双酶切鉴定后，将含有p EASY－T1－Eg AgB8/3重组质粒的Trans1－T1菌液送上海生物工程有限公司测序，利用DNA man软件和Bio Edit软件对测序后序列进行分析。

1.2.3 p TWIN1－Eg AgB8/3原核表达质粒的构建 大量提取空质粒p TWIN1和p EASY－T1－Eg AgB 8/3重组质粒，分别用EcoR I和BamH I双酶切p TWIN1和p EASY－T1－Eg AgB8/3，带有黏性末端的Eg AgB8/3目的基因和线性化的p TWIN1载体经DNA切胶回收试剂盒回收，按4∶1的体积建立20μL连接反应体系：目的片段12μL，载体3μL，10×连接缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL，去离子水2μL，22℃过夜连接。连接产物转化至氯化钙法制备的E.coliER 2566感受态细胞中，涂布于氨苄抗性的LB平板上，37℃恒温箱中倒置培养过夜。同时设空质粒阳性对照及空白板阴性对照。从转化平板上挑取单菌落，220 r/min，37℃摇菌过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定，随机挑选5个PCR扩增鉴定正确的单斑小提质粒，委托上海生工公司测序鉴定。

1.2.4 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白的表达 用接种环挑取测序鉴定正确的重组表达载体p TWIN1－Eg AgB8/3－E.coliER2566，接种于10m L液体LB（Amp＋）培养基中，37℃、220 r/min摇菌过夜。按2.0%的接种量将摇过夜的菌转接至500m L含氨苄青霉素（50μg/m L）的液体LB培养基中，培养至OD 600≈0.6时，加入通过试验后获得的最佳的表达条件即终浓度为0.5 mmol/L的IPTG、35℃、诱导表达4 h，同时取1m L未加诱导剂的菌液在相同的温度、时间培养作为空白对照。诱导后的菌液于8 000 r/min、4℃离心10 min，弃上清收菌，用磷酸盐缓冲液（PBS p H7.4）在同样的离心条件洗涤2次，液氮快速冷冻并于μ20℃保存，第2 d用 冰 预 冷 Buffer Bl（20 mmol/L Tris－HCl；500 mmol/L NaCl；1mmol/L EDTA，p H 8.5）重悬细菌沉淀，加入蛋白酶抑制剂（PMSF），冰浴超声后13 000 r/min离心分别取上清和沉淀，待SDS－PAGE分析重组蛋白表达情况。

1.2.5 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白结合几丁质柱自剪切裂解目的蛋白r Eg AgB8/3 利用有自剪切功能的原核表达载体p TWIN1，其表达蛋白内含肽（Ssp－DnaB－intein）是一段存在于前体蛋白中的蛋白序列，构建目的基因于内含肽标签intein1（25 k Da）上，其N末端融合有chitin binding domain（CBD），它可使融合蛋白吸附于几丁质（Chitin）柱上，在蛋白质成熟加工过程中自行剪切去除，可一步获得纯的目的蛋白。实验步骤：（1）往柱上加4 mL的几丁质树脂，用40 m L的B1缓冲液以0.5～1 m L/min的速率平衡柱子。（2）以0.5～1 m L/min的速率缓慢的向柱子上加样（超声后收集的上清）收集流出的上清待SDS－PAGE分析，用60 m L Buffer Bl缓冲液保持以0.5～1 m L/min的速率清洗柱子。（3）用12 m L Buffer B2缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl；500 mmol/L NaCl；1 mmol/L EDTA，p H 7.0）快速的冲洗柱子后，再用4 mL的B2缓冲液25℃孵育48 h。（4）第2 d，用总量为12 m L的Buffer B2缓冲液洗脱柱子，取样待SDSPAGE分析融合蛋白纯化的效率。

1.2.6 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白和目的蛋白r E－g AgB8/3的 Western blot鉴定 融合蛋白的 Western blot鉴定：按Invitrogen公司推荐的方法将蛋白质转移至PVDF膜上，置于10 m L封闭液中，37℃封闭1 h；取一抗（抗CBD的兔抗血清）以1∶5 000稀释，4℃过夜孵育；第2 d用WesternBreeze试剂盒提供的洗膜液室温洗涤4次，每次5 min；取WesternBreeze试剂盒提供的二抗（碱性磷酸酶标记的鼠抗兔IgG抗体），37℃反应2 h；室温洗涤4次，每次5 min；加入适量BCIP/NBT显色液振摇至条带清晰后，用蒸馏水终止反应。r Eg AgB8/3蛋白的Western blot鉴定：一抗为实验室保存的纯化后的Trx－Eg AgB8/3重组蛋白兔多克隆抗体，以1∶1 000稀释，4℃过夜孵育，二抗的孵育和显色方法同前文。

2 结 果

2.1 Eg AgB8/3基因分泌型多肽片段核酸序列的PCR扩增结果 以重组质粒p ET32a－Eg AgB8/3模板，P1和P2为引物扩增后，得到大小为207bp的Eg AgB8/3 DNA片段，与预测片段大小相符（图1）。

图1 EgAgB8/3 PCR扩增产物Fig.1 PCR product of EgAgB8/3M ：DL2 000 DNA maker；1－2：PCR products

2.2 p EASY－T1－Eg AgB8/3重组质粒的鉴定 用质粒小量抽提试剂盒提取经蓝白斑筛选的阳性克隆菌株质粒。经PCR扩增与EcoR I和BamH I双酶切p EASY－T1－Eg AgB8/3重组质粒后，琼脂糖凝胶电泳鉴定均可见酶切后得到大小约207 bp的片段，符合目的基因预期大小，测序结果与已报道的Eg AgB8/3基因（GenBank登录号为AF362442）的序列完全一致，同源性为100%。

2.3 p TWIN1－Eg AgB8/3原核表达质粒的鉴定双 酶 切 p EASY－T1－Eg AgB8/3 重 组 质 粒 和p TWIN1表达质粒，并切胶回收Eg AgB8/3目的基因和p TWIN1线性化的载体大片段，T4 DNA连接酶连接，定向克隆构建p TWIN1－Eg AgB8/3原核表达质粒，经转化、培养、小量提取质粒后，用PCR法及EcoR I和BamH I双酶切p TWIN1－Eg AgB8/3原核表达质粒均可得到207 bp的DNA片段，与预期产物一致（图2）。

图2 重组质粒pTWIN1－EgAgB8/3PCR及酶切鉴定结果Fig.2 Conformation of p TWIN1－EgAgB8/3 recombinant plasmid by PCR and restriction enzyme digestionM：DL10 000 DNA maker；1－2：Eg AgB8/3 PCR products；3：Recombinant plasmid fragments digested by Eco R I and Bam H I

2.4 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白的表达纯化鉴定 将p TWIN1－Eg AgB8/3重组质粒转化入Eg AgB8/3－E.coliER2566感受态细胞中，接种培养后诱导4 h，菌液超声离心后分别取上清和沉淀（图3第3条泳道和第4条泳道）作SDS－PAGE分析，可见在33 k Da处出现明显的普带，说明融合蛋白已成功表达并为可溶性蛋白，通过融合蛋白N末端融合的CBD蛋白吸附于几丁质柱上，并在蛋白质成熟加工过程中自行剪切去除，获得高纯度目的蛋白r Eg AgB8/3（如图3第6、7、8泳道），图3第5泳道为纯化时超声后上清蛋白样品通过几丁质树脂结合后流出的样品，在33 k Da处没有融合蛋白条带，可见几丁质结合 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白的效率几乎为100%。

2.5 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白和目的蛋白r Eg AgB8/3的 Western blot鉴定 对表达后的融合蛋白进行Western blot鉴定，可以看到在30 k Da处有两条清晰的特异性条带，一条为33 KDa的重组蛋白，另一条为降解了的蛋白片段（图4a），对纯化后得到r Eg AgB8/3蛋白进行Western blot鉴定，可看到8 k Da处有清晰的唯一的特异性条带（图4b）。

图3 融合蛋白的表达纯化SDS－PAGE分析图谱Fig.3 SDS－PAGE analysis of expressed and purified fusion proteinM：Protein molecular weight marker；1：Supernatant of uninduced bacterial lysate；2：Pellets of uninduced bacterial lysate；3：Supernatant of bacterial lysate induced by IPTG for 4h；4：Pellets of bacterial lysate induced by IPTG for 4h；5：Crude cell extract after passage over chitin beads.The precursor binds to the resin through the chitin binding domain；6－8：A fraction eluted from the chitin beads after inducing cleavage of the intein－tag.

3 讨 论

棘球蚴病是棘球绦虫寄生于人及某些动物体内所致的一种严重的人兽共患性疾病，呈世界性分布，我国是该病发病率最高的国家之一。瞿群［8］等通过调查研究显示疫区家犬对细粒棘球绦虫具有很高的感染率，且与当地居民和家畜包虫病的患病率基本保持一致，所以对犬感染Eg的监测是了解当地包虫病流行状况和控制效果的有效手段。

图4 纯化前、后融合蛋白和目的蛋白的Western blot鉴定结果Fig.4 Western blot analysis of the fusion proteins and target protein after auto－cleavageFig.4a Fusion proteins before purificationM：Protein molecular weight marker；1－4：Fusion proteins 6，8，10 and 12μL，respectivelyFig.4b Target protein after purificationM：Protein molecular weight marker；1－4：10μL of fusion，1，2，4 and 8μg/μL，respectively

Eg AgB8/3抗原具有虫体分泌性抗原、成虫阶段大量表达、棘球绦虫属特异性3个重要特点。为使其能够成为棘球绦虫感染犬粪抗原的ELISA夹心法检测的特异性靶蛋白，本文构建具剪切功能的原核表达载体p TWIN1－Eg AgB8/3，p TWIN1载体利用T7启动子在IPTG诱导下实现高水平和严谨表达调控［9］，与其它表达载体表达的带有特殊标签的重组蛋白相比，表达后的融合蛋白经简单后续处理即可获得含极少额外氨基酸的可溶性目的蛋白，尽可能保证了其原有的结构和活性，在后续目的蛋白抗原免疫动物制备抗体时，可避免因含额外蛋白标签产生非特异性抗体导致抗体检测天然抗原时产生的交叉反应。

p TWIN1载体表达的内含肽（Intein）是一种蛋白剪切元件（Protein splicing element），它是一些读框区中打断宿主基因编码区的序列。与内含子（Intron）不同的是，它在翻译后通过改变p H和温度条件诱导Intein自身催化剪切裂解，使其与目的蛋白断裂。研究中将 Eg AgB8/3 融合到Ssp－DnaB－intein（intein 1）的C端，而intein 1的N末端融合有chitin binding domain（CBD），诱导表达后的融合蛋白中intein 1两端分别连接CBD结构域和目的蛋白，表达后的融合蛋白在经过几丁质柱（Chitin）纯化时，通过CBD的结合域附于Chitin柱上，intein 1和目的蛋白之间进行自剪切裂解［10－12］，用相应的洗脱液将目的蛋白洗脱，从而收集到高纯度的目的蛋白，在图3中第3条泳道33 k D左右较宽的条带为纯化前的蛋白，纯化后可见第6、7、8条泳道中8KD处唯一的条带其纯度＞90%，可见此种方法纯化蛋白的效率很高。由图4分析CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白为不稳定蛋白易降解，因此在蛋白质的超声的过程中应尽可能缩短操作时间并在4℃完成分离和纯化过程，同时在缓冲液中加入相应的蛋白酶抑制剂和还原剂，以防止蛋白的降解。

本课题构建的重组表达载体采用了“可诱导的内含肽自身剪切”技术，使内含肽在适当的p H或还原条件进行自身剪切，与其它表达载体对比无需配制不同浓度的洗脱液就可将目的蛋白在经过亲和层析后从融合表达的蛋白中分离出来，大大提高了纯化效率，从而能够更大程度上保留其天然生物活性。为后续研究Eg AgB8/3的单克隆抗体的快速制备奠定了重要的基础，并有望成为细粒棘球绦虫感染犬粪抗原的免疫学诊断的新途径。

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