3株嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白原核表达及免疫原性差异性研究

姚 娜，陈创夫，于 强，张丽娟

2.中国疾病预防控制中心传染病所无形体室，北京 102206

嗜吞噬细胞无形体属于立克次体目无形体科无形体属，是一类经蜱传播的严格细胞内寄生的革兰氏阴性菌，主要引起人粒细胞无形体病（HGA）。20世纪90年代初美国首次发现以来，澳洲、欧洲多国、韩国及我国先后均有报道，且近年呈上升趋势［1－3］。天津及山东沂源县调查结果显示当地人群人粒细胞无形体IgG抗体阳性率分别为8.8%和26.7%［4－5］。2006年安徽芜湖弋矶山医院人粒细胞无形体院内传播感染事件是中国第一次报道的人粒细胞无形体感染确诊病例，也是世界范围内首次报告的人粒细胞无形体人传人事件［6］。

目前认为该病原的重要致病效应子是嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白，该蛋白经Ⅳ型分泌系统分泌，特异的结合宿主核DNA和DNA结合蛋白，影响和改变宿主细胞一些蛋白质结构或功能，从而抑制宿主细胞的免疫应答［7－9］，如Ank A与宿主染色质调控结构域的相互作用引起CYBB/gp91pbox基因表达下调，而这两个基因编码吞噬细胞氧化酶复合物的一个重要组分［10］，由此，导致中性粒细胞一系列功能如脱颗粒、呼吸爆破、趋化游走及氧化杀伤病原微生物能力丧失等。最新研究证实ank A基因的变异性决定宿主易感性［11］，即人源、动物源及不同种类动物分离株ank A基因表现遗传异质性。为探索人源无形体不同分离株Ank A蛋白免疫原性差异，进一步揭示因结构及免疫表位差异导致与宿主细胞作用差异，我们对3株无形体不同ank A基因进行了原核表达及免疫原性初步分析。

1 材 料

1.1 菌株和对照血清 3株嗜吞噬细胞无形体人分离株DNA（Webster株，斯洛文尼亚1 567株，美国96HE58株）为美国Johns Hopkins大学医学院JS.Dumler实验室惠赠，HGA病人血清为本室2009－2010年临床收集的经病原学（4例）、分子生物学（5例）及血清学诊断病例（10例）混合血清。正常人血清为本室工作人员混合血清。

1.2 载体E.coliDH5α和BL21（DE3）为本实验室保存，表达质粒p ET30a（＋）购自Novagen公司。1.3 实验动物 SPF级Balb/c小鼠，雄性，体重（18～22 g），由北京海淀区兴隆实验养殖场提供，许可证号：SCXK－（军）2007－004。Balb/c小鼠饲养在中国CDC动物实验中心SPF级实验动物室。由获得动物饲养资质的管理人员饲养。

1.4 主要试剂 DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；EcoRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自大连宝生物有限公司；DNA和蛋白Marker购自天根生物有限公司；质粒提取和PCR产物回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；HRP标记羊抗人、羊抗鼠IgG（H＋L）购自北京昌盛鼎国公司；Ni－NTA His－Bind Resin，色谱柱购自Novogen公司。

1.5 主要仪器 PCR扩增仪为MJ Research PTC－100 Peltier thermal cycler；蛋白测量仪为BIO－RAD公司SmartSpecTM3000；质谱分析仪为美国ABI公司4700 proteomics analyzer；酶标仪为美国伯腾公司BIO－Te K Elx50TM酶标仪。PAGE电泳及western blot转印仪分别为BIO－RAD公司 Mini－PROTEAN4和170－3930Mini Trans－Blot C。

2 方 法

2.1 Ank A蛋白生物信息学分析及预测 从Gen－Bank（http：//www.ncbi.nlm.nihgov/）中下载3条嗜吞噬细胞无形体分离株Ank A蛋白序列，包括Webster株（GU236811.1），1 567株（GU236801.1）和96 HE58株（GU236808.1），用 MEGA5.0软件分析序列一致性和保守区，利用DNASTAR综合序列分析软件中的Protean模块预测分析B细胞抗原表位，采用 Kyte－Doolittle亲水性方案、Karplus－Schulz柔韧性方案、Emini表面可及性方案、Jameson－Wolf抗原指数方案和Chou－Fasman二级结构预测方案综合预测。

2.2 引物设计和基因扩增 经过上述生物信息学分析后选择保守区，用Primer premer5.0软件设计引物，引物序列及相对位置如下：Ank A－F引物5′－ATGAATTCATGCTGCCGCCTGAAAGTCC－3′（核酸序列2701－2720（Webster）、2704－2723（1 567株）、2704－2723（96 HE58株），下划线为EcoRⅠ酶切位点），Ank A－S引物5′－CCGCTCGAGCTATTT GTCTTTGGTAG－3′（核酸序列 3464－3480（Webster）、3440－3456（1 567 株）、3467－3483（96HE58株），下划线为XhoⅠ酶切位点），以上述3株无形体人分离株基因组DNA为模板，PCR扩增ank A基因。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共40循环；72℃再延伸10 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.3 重组质粒的构建与鉴定 PCR产物纯化后及p ET－30a载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接，连接产物转化E.coliDH5α，卡那霉素抗性筛选阳性重组子，提取重组质粒PCR鉴定，阳性质粒送北京擎科生物公司测序。

2.4 蛋白表达和纯化 重组质粒pET－30a－Anka转化E.coliBL21（DE3），终浓度 0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h，离心收集诱导产物的上清和沉淀，PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达形式。阳性重组菌经大量诱导并收集上清，经镍柱纯化，使用咪唑洗脱目的蛋白。BCA法测定重组蛋白浓度。

2.5 重组蛋白飞行质谱分析 将纯化蛋白送至中国疾病预防控制中心传染病所诊断室进行蛋白飞行质谱分析。

2.6 重组蛋白免疫原性检测

2.6.1 小鼠免疫 将小鼠随机分为3组，每组5只，3只免疫，2只对照，将纯化的重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，以100μg/只的抗原剂量经背部皮内多点免疫小鼠，初次免疫后第14和28 d，分别将重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合和不含佐剂重组蛋白，以50μg/只加强免疫；对照组以生理盐水代替重组蛋白，第3次免疫10 d后经心脏采血，分离血清。

2.6.2 免疫抗体水平检测 采用酶联免疫吸附试验（间接ELISA）检测免疫鼠抗体水平。简述为：纯化重组蛋白1.5μg/孔包被酶标板，常规ELISA法检测每组小鼠免疫后混合血清中抗Ank A IgG抗体的几何平均滴度。

2.6.3 免疫原性分析 3株嗜吞噬细胞无形体人分离株Ank A重组蛋白分别经12%SDS－PAGE转印到PVDF膜上，膜与免疫鼠血清（1∶400、1600）、我国人 HGA阳性血清（1∶20、40、80）4℃作用过夜，与辣根过氧化物酶标羊抗鼠、羊抗人IgG（H＋L）按1∶10 000稀释后反应1 h，DAB显色。

3 结 果

3.1 免疫原表位预测 Ank A蛋白B淋巴细胞抗原表位预测分析结果见图1。我们选取转角、无规则卷曲；亲水性部位；抗原指数及表面可及性分值高部位，同时3条序列差异性较大片段。Webster株选取核酸序列2701－3480、1 567株选取2704－3456、96HE58株选取2704－3483为引物设计区域。为进一步了解3株菌Ank A原核表达片段抗原表位的异同，用 IEDB 中 Protean （http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb＿input）预 测 分 析Ank A克隆表达片段B细胞线性表位（图2）。

图1 3株嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白B淋巴细胞抗原表位预测分析结果A：Webster株、B：1 567株，C：96 HE58株Fig.1 B lymphocyte epitope prediction of Ank A protein from 3 isolates of A.phagocytophilum by ProteanA：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain

3.2 PCR及重组表达质粒鉴定 PCR扩增产物经琼脂糖电泳鉴定可见分别约780 bp（Webster株），750 bp（1 567株），780 bp（96 HE58株）特异性基因条带，见图3A。3株菌Ank A蛋白重组质粒双酶切鉴定见图3B和3C。重组质粒测序结果经Blast序列比对分析，质粒p ET30a（＋）－Ank A（Webster株）中ank A序列与GenBank中登录的GU236811.1基因序列完全一致；质粒p ET30a（＋）－Ank A（1 567株）中ank A序列与GenBank中登录的GU236801.1基因序列完全一致。质粒p ET30a（＋）－Ank A（96 HE58株）中Ank A序列与GenBank中登录的GU236808.1基因序列完全一致。

3.3 重组蛋白表达与纯化 重组质粒的表达产物经SDS－PAGE分析，可见相对分子质量约45 k Da的预期蛋白条带，主要以可溶性形式存在，纯化后的蛋白条带单一（图4）。

图2 3株嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白B淋巴细胞线性表位预测分析结果A：Webster株、B：1 567株，C：96 HE58株Fig.2 B lymphocyte linear epitope prediction of Ank A protein from 3 isolates of A.phagocytophilum by ProteanA：Webster strain；B：1 567 strain；C：96HE58 strain

3.4 重组蛋白鉴定 纯化蛋白飞行质谱分析结果显示酶解肽段均来自于嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白（图5）。3种蛋白质氨基酸序列与预期的Webster株、1 567株及96 HE58株均100%同源。

图3 目的基因PCR扩增结果（A）及重组质粒pET30a（＋）－Ank A双酶切鉴定（B和C）Fig.3 PCR amplification of target ank A gene（A）and identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion（B and C）A—M：DNA marker DL2000；1－3：PCR production by using template of DNA （1：Webster strain；2：1 567 strain；3：96HE58 strain）；N：Negative control.B—M1：DNA marker DL2000；M2：DNA marker DL15000；1－2：Recombinant plasmids after enzyme digestion（1：Webster strain；2：1 567 strain）；3：Pre－digestion recombinant plasmids.C—M：DNA marker DL2000；1：Recombinant plasmids after enzyme digestion（96HE58 strain）.

3.5 小鼠免疫抗体水平 ELISA检测3组小鼠免疫抗体水平结果发现，每个实验组中，对照组小鼠免疫前后抗体水平无变化，而免疫小鼠免疫后抗体水平较免疫前显著升高，其中Webster株平均抗体滴度达1∶25 600，1 567株抗体平均为1∶12 800，96HE58株平均为1∶25 600。

3.6 重组蛋白免疫原性分析 采用我国人粒细胞无形体病患者阳性血清与重组蛋白Western blot分析，结果显示纯化的Ank A重组蛋白可与人粒细胞无形体病患者阳性血清发生特异性结合反应（图6）。实验使用的病人混合血清采用美国FOCUS间接免疫荧光诊断试剂（抗原为美国本土分离株）检测抗体效价为1∶80。本研究Webster株重组蛋白与HGA病人阳性血清反应，效价为1∶80，1 567株重组蛋白效价1∶20反应，96HE58株重组蛋白效价1∶80。

3.7 Ank A重组蛋白交叉免疫分析 由于用同一个引物扩增出3株嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白的DNA片段，并对其核苷酸测序后分析发现3条序列存在差异性，并对这3条序列进行B细胞线性表位预测分析（图2）发现其抗原表位存在差异，因此对Ank A重组蛋白与小鼠免疫后血清进行交叉Western blot反应实验，结果（图7）显示3株无形体Ank A蛋白鼠免疫多克隆抗体交叉免疫滴度无显著差异，同时ELISA实验结果与Western blot相同。

图4 纯化后重组蛋白SDS－PAGE凝胶电泳结果A：Webster株 ；B：1 567株；C：96HE58株Fig.4 SDS－PAGE analysis of the purified recombinant proteinM：Protein marker；1：Purified recombinant Ank A proteinA：Webster strain；B：1 567 strain；C：96HE58 strain

图6 Ank A重组蛋白免疫印迹分析A：Webster株 ；B：1 567株；C：96HE58株Fig.6 Western blot analysis of recombinant Ank A proteinM：Protein marker；1：Recombinant protein recognition by HGA positive human sera（1∶20）；2：Recombinant protein recognition by HGA positive human sera（1∶40）；3：Recombinant protein recognition by HGA positive human sera（1∶80）；4：Recombinant protein after incubation with normal human sera（1∶20）.A：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain

4 讨 论

在嗜吞噬细胞无形体侵染宿主及致病过程中，Ank A蛋白是重要的效应子。该蛋白严重干预宿主细胞免疫应答，对病原菌的入侵和胞内复制起到关键作用。Ank A蛋白的遗传异质性与宿主侵染易感性以及临床致病严重程度密切相关。有研究认为锚蛋白重复叠加形成L形结构域介导蛋白质－蛋白质相互作用［12］。

本文通过原核基因工程技术克隆表达了3株来自欧美地区的嗜吞噬细胞无形体致病菌株Ank A蛋白，并在大肠杆菌表达系统中获得高效表达，纯化后经飞行质谱分析，表达的重组蛋白氨基酸序列与预期蛋白100%同源。通过免疫印迹分析，与我国自然感染的人粒细胞无形体病病人阳性血清具有良好图5 重组蛋白飞行质谱报告

A：Webster株；B：1 567株；C：96HE58株

Fig.5 Identification of the recombinant Ank A protein by mass spectrum analysis

A：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain的免疫反应。其抗原抗体Western blot反应效价与美国FOCUS间接免疫荧光检测效价基本一致。说明我们表达的重组蛋白具有良好的天然免疫原性。3株菌Ank A重组蛋白免疫Balb/c小鼠，均能刺激机体产生抗体，并获得较高抗体滴度，显示3株重组蛋白具有良好的免疫原性。

图7 3株Ank A重组蛋白免疫抗体交叉反应A：Webster株 ；B：1 567株；C：96HE58株Fig.7 Western blot analysis with mouse sera immunized by recombinant Ank A proteinM：Protein marker；1：Mouse sera immunized with Webster strain recombinant Ank A protein（1∶400）；2：Mouse sera immunized with Webster strain recombinant Ank A protein（1∶1 600）；3：Mouse sera immunized with 1 567 strain recombinant Ank A protein （1∶400）；4：Mouse sera immunized with 1 567 strain recombinant Ank A protein（1∶1 600）；5：Mouse sera immunized with 96HE58 strain recombinant Ank A protein（1∶1 600）；6：Mouse sera immunized with 96HE58 strain recombinant Ank A protein 1∶1 600）；7：Pre－immunized mouse sera（1∶100）.A：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain

氨基酸序列比对分析发现Webster株和96HE58株Ank A重组蛋白存在一个氨基酸不同，而与1 567株氨基酸序列差异较大，3株Ank A重组蛋白的一致性为91.6%。尽管如此，通过对3株嗜吞噬细胞无形体重组蛋白与免疫鼠血清多克隆抗体Western blot交叉反应实验，结果显示存在明显的交叉反应，由此推测重组蛋白氨基酸一级序列上存在的差异并未对蛋白抗原性产生影响，不同株间重组蛋白与免疫小鼠血清均能发生反应。

本实验成功表达了3株嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白，通过免疫小鼠多克隆抗体交叉反应实验，没有检测出3株嗜吞噬细胞无形体Ank A蛋白免疫原性间的差异。

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