大连市“蜱咬”患者新布尼亚病毒（SFTSV）的检测分析

刘 芸，张 洁，王 博，田 疆，毛玲玲，孙英伟，王子江，孙婷婷，姚文清，赵 卓

病毒性出血热是一种临床症状表现为急性发热和出血的疾病，病原体为人兽共患及节肢动物携带传播的RNA病毒。目前在我省最常见的出血热病毒应属布尼亚科病毒。有致肾综合征出血热的汉坦病毒［1－2］和布尼亚病毒［3］。2011年6－8月我省大连地区的农民相继出现不明原因出血样症状 ，一名“蜱咬”患者因疑似肾综合征出血热而就诊于大连市第六人民医院，我们对其展开了流行病学调查及实验室病原体检测。

1 材料与方法

1.1 样本

1.1.1 血液样本 据流行病学调查结果，采集“蜱咬”患者急性期血液样本及同居住地的26份非患者血清样本。

1.1.2 蜱虫样本 该患者有蜱虫叮咬史，入院后在其腋下发现叮咬蜱虫一只。2011年8月又采集了“蜱咬”患者所在地及相邻村庄路边草丛及牛、犬体表叮咬的长角血蜱虫94只，分成19组，放入不同瓶中标记。

1.2 核酸的提取及检测 采用QIAGEN公司提供的EZ1 Virus Mini Kit V2.0试剂盒提取RNA，详细操作步骤按说明书要求进行。采用Real－Time PCR方法检测SFTSV核酸。核酸检测试剂盒由中山大学达安基因公司提供。

1.3 血清学检测 采用ELISA方法对“蜱咬”患者急性期血清样本进行SFTSV的Ig M抗体检测；对同居住地的26份非患者血清样本进行SFTSV的IgG抗体检测。试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供。

1.4 病毒分离 将VERO－E6细胞培养至单层（VERO－E6细胞由中国疾病预防控制中心病毒所，以下简称“病毒所”提供。）接种“蜱咬”患者血清、叮咬的蜱悬液以及19组蜱虫研磨悬液0.3 mL，吸附2 h后换维持液，盲传3代，观察细胞病变（CPE）。新布尼亚病毒致VERO－E6细胞病变特点为细胞被感染9～12 d后出现脱落、溶解变形，呈柳叶状病变出现缓慢但维持时间长［4］。刮取少量细胞悬液滴入凹孔玻片吹干后冷丙酮固定，并用间接免疫荧光法（IFA）检测病毒抗原。

1.5 病毒滴度测定 将处于对数生长期的VERO－E6细胞接种96孔细胞培养板，用Hanks液将分离的病毒倍比稀释为10－1～10－1212个浓度的病毒液，每孔接种病毒液100 μL，平行4孔，吸附2 h后弃Hanks液，补加 MEM维持液300μL，5%CO2、37℃培养15 d观察细胞病变。Karber法计算TCID50。

1.6 病毒鉴定 采用7对SFTSV的M片段全基因测序引物对分离到的毒株进行RT－PCR扩增，并对扩增产物进行测序。SFTSV的M片段的RT－PCR反应体系和反应条件全部由病毒所提供。

2 结 果

2.1 血清学检测 “蜱咬”患者急性期血清样本SFTSV的Ig M抗体阳性、IgG抗体阴性；26份非患者血清样本中4份SFTSV的IgG抗体阳性。

2.2 核酸检测 “蜱咬”患者血液样本及其叮咬的蜱虫SFTSV核酸阳性，采集的94份长角血蜱样本SFTSV核酸均为阴性。

2.3 病毒分离及滴度测定 牛、羊、犬体表叮咬的蜱虫悬液细胞培养均为阴性。“蜱咬”患者血液及其叮咬的蜱虫经VERO－E6细胞培养后均获得阳性分离株。分别被命名为：LNDL－2011－XQ（辽宁大连－2011年－血清分离株），LNDL－2011－PC（辽宁大连－2011 年－蜱 虫 分 离 株 ）。 对 LNDL－2011－XQ 株、LNDL－2011－PC株及我省抚顺和丹东的分离株同时进行病毒滴度测定，结果大连分离株滴度为10－6，其他地区为10－5。

2.4 系统发生分析RT－PCR产物用QIAGEN胶纯化试剂盒（QIA quick Gel Extraction K it）纯化，操作按试剂盒说明书。纯化后产物送上海英维捷基（Invitrogen）贸易有限公司进行序列测定。测序结果的比对及相似性分析使用软件Bioedit；同源性分析以及进化树的构建通过MEGA4完成。用于构建系统发生树的SFTSV病毒各基因型代表株的参比序列来自NCB I的GenBank。见图1。

图1 新布尼亚病毒分离株M基因遗传进化分析Fig.1 Phylogenetic tree of M gene in SFTSV strains

3 讨 论

患者临床症状、体征及血清学检测结果显示为新布尼亚病毒感染者。虽然其家人或其他密切接触者未发生感染。因病人血液中病毒含量较高，初代培养时细胞呈现明显的病变，不排除有人传人的可能性。健康人群调查表明：有隐性感染者存在，因样本量太少目前还不能确定正常人群自然感染后抗体的保护水平。有待于在今后的监测工作中进一步完善。

传播媒介的调查结果显示，在患者居住的村庄及周边山村小路采集的野外长角血蜱与动物体表叮咬的蜱虫均未检测到SFTSV抗原，可能与样本量少有关。但患者体表叮咬的蜱新布尼亚病毒分离成功，这一结果将进一步提示，该病可能为一种由蜱传播的自然疫源性疾病［5－6］。

表1 患者和蜱虫病毒分离株M基因核苷酸与其他新布尼亚病毒分离株同源性比较Tab.1 Homology comparison on partial nucleotide sequence of SFTSV M gene from patient and tick to other strains（%）

SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，为分节段的负链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，直径80－100nm，病毒基因组分为L、M、S 3个片段［7］。系统发生分析表明：大连地区SFTSV分离株（LDL2011－PC，LDL2011－XQ及LDL2011－15）与国际标准的白蛉病毒株序列亲缘性较近但存在着明显的不同种的现象，且存在着明显的地域聚集特点，区别于我省丹东分离株；其次，抗原滴度测定表明大连分离株较其它地区分离株滴度高毒力强。从患者体表叮咬的蜱虫分离株与该患者血清分离株M片段碱基序列做比对同源性达99.7%，说明该患者的发病与其叮咬的蜱虫自身携带的病毒有密切关系。大连地区分离株与辽宁2号株（LN2：辽宁抚顺株）、丹东株（LDD2011－1）及河南6号株遗传距离较近。

试验与调查结果显示：即我省丹东、抚顺、铁岭地区自2009起因获得SFTSV分离株被确定为疫区外，大连地区亦成为新布尼亚病毒存在的疫源地。

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