日本血吸虫TOM34基因的克隆和表达分析

洪 炀，李学珍，，傅志强，石耀军，陆 珂，杨健美，朱传刚，苑纯秀，李 浩，李祥瑞，林矫矫

2.南京农业大学动物医学院，南京 210095

血吸虫病（schistosomiasis）是由血吸虫感染人或其他哺乳动物而导致的一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病（zoonosis）。该病流行于全球的76个国家和地区，有约6亿人受到威胁，2亿人感染［1］。根据我国卫生部统计：2010年血吸虫病仍在我国3 520个乡镇流行，患病人数达32.58万人［2］。目前，血吸虫病的防治主要依赖于化学药物吡喹酮的使用，但是这种方法在血吸虫病未消灭地区只能暂时降低发病率，不能彻底阻断该病的传播。同时，药物治疗对已造成损伤的组织无法修复，并且不能防止病人、病畜再次感染。近年来，在曼氏血吸虫和日本血吸虫中都已经出现了吡喹酮的耐药虫株［3－4］。吡喹酮是目前唯一大规模使用的血吸虫病治疗药物，耐药虫株的出现引起了人们的高度关注。因而加强抗血吸虫疫苗和新治疗药物的研发格外重要。

研究表明，日本血吸虫在不同适宜性宿主体内的生存状态是不同的，这可能是因为不同的宿主为日本血吸虫提供了不同的生存环境，从而影响到虫体的生存和发育。本课题组近期利用荧光差异凝胶双向电泳对来源于日本血吸虫易感宿主小鼠、非易感宿主大鼠和抗性宿主东方田鼠10 d童虫的差异表达蛋白进行了比较分析，结果显示不同适宜性宿主来源童虫的蛋白表达存在差异，其中一些差异表达的蛋白可能是虫体生存发育所需要的关键分子［5］。本文选择其中一个差异表达蛋白—线粒体外膜转运酶34（SjTOM34）进行了初步的研究。

线粒体是真核细胞中能量代谢的重要场所，它除了产生ATP外，还可以代谢氨基酸、脂类和铁硫簇等其他重要的化合物。此外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。线粒体中含有的蛋白种类大约占整个细胞的25%，在哺乳动物细胞中大约为1 500种，这些蛋白中大约有99%是在细胞质中合成之后被转运至线粒体内的［6］。在这个过程中，线粒体的外膜转运酶（translocase of the outer mitochondrial membrane，TOM）发挥了重要的作用，它们通过主动运输的方式将这些线粒体前体蛋白运输到线粒体内［7］。近几年，国外许多学者对TOM34进行了相关研究，认为该蛋白在胞质中大量分布，在线粒体膜上也有部分分布，并且认为它在线粒体前体蛋白进入线粒体的过程中发挥着重要的作用［8－9］。尽管 TOM34在哺乳动物细胞中已有一些相关研究，但有关血吸虫TOM34蛋白国内外尚未见报道。

本研究以SjTOM34为研究对象，对该基因进行了克隆、表达及相关的生物信息学分析，制备了针对该基因的多克隆抗体，分析了该基因在不同时期虫体内mRNA水平和蛋白水平上的表达情况，对该基因在虫体内的分布情况进行了免疫定位，为进一步研究该基因的生物学功能及作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 寄生虫、质粒、菌种及实验动物 日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供；大肠埃希氏杆菌（E.coli）DH5α、BL21和质粒p ET28a（＋）均为本实验室保存；6 w龄的雌性BALB/c（20～25 g）小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，雄性新西兰大白兔（2.5 kg～3.0 kg）购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。

1.1.2 相关试剂 TRIzol购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒、SYBR GreenⅠ、EASY Dilution、p MD19－T载体、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、DNA marker（DL2000，DL15000）购自 Ta KaRa生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒购自Axygen公司；Ni－NTA HisBind Resin购自Novagen公司；沉淀型单组分TMB底物溶液、可溶性单组分TMB底物溶液购自天根生物科技（北京）有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自Whatman公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗、Cy3标记的山羊抗小鼠IgG二抗、DAPI溶液购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 虫体收集 新西兰大白兔腹部贴片感染3 000～20 000条日本血吸虫尾蚴，于感染后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d分别剖杀，以灌注法从肝门静脉收集虫体，用灭菌的PBS充分冲洗虫体。用吸管将部分42 d合抱的成虫反复吹打，使合抱的雌雄虫分开，分别收集雌虫和雄虫，将各时期的虫体保存于液氮中备用。

1.2.2 总RNA及虫体蛋白的提取 取液氮中保存的7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d日本血吸虫，按TRIzol试剂盒说明书分别提取总RNA，将42 d的RNA反转录为c DNA，－80℃保存备用。

取液氮中保存的7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d日本血吸虫，各称取相同重量20 mg，加入250μL RIPA裂解液，用研磨棒对虫体进行充分研磨。随后加入苯甲基磺酰氟化物（PMSF），使其最终浓度为1 mmol/L。冰上超声5次，每次超声5 s，停15 s。之后在4℃下，12 000 r/min离心20 min，吸取上清放于－80℃备用。

从行走机构和翻转机构的模态振型图可以看出，各个频率的振型差别较大。各阶模态振型可分为整体模态和局部模态。其中，第一阶、第三阶和第四阶为局部模态，第二阶和第五阶为整体模态，第六阶为整体扭曲变形模态。各阶模态振型说明如表2所示。

1.2.3SjTOM34序列的扩增及生物信息学分析

本实验室之前对来源于小鼠、大鼠、东方田鼠的日本血吸虫10 d童虫差异表达蛋白的研究中，获得了一个EST序列（登录号：FN315604.1），根据该EST序列设计上下游引物，进行PCR扩增。上游引物：5′－ATGAAACCTGAACAGATTTCCATGCTC－3′，下 游 引 物：5′－CTAGTCTAAGTCTGGACATGATTGGTTAG－3′。以日本血吸虫35 d成虫cDNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94℃预变性5 min；然后94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，共30个循环；循环结束后72℃延伸10 min，将PCR产物纯化后送上海英俊生物技术有限公司进行测序。

将测序得到的c DNA序列利用DNAStar软件分析该序列的开放阅读框，氨基酸残基数目、组成，理论相对分子质量及等电点，同时在美国国家生物技术信息中心（NCBI）利用 BLAST 软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列的相似性和同源性分析，通过Clustal X软件将蛋白序列进行多重比对，绘制出系统进化树。利用SignalP软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对蛋白的信号肽进行预测；利用Ex PASy服务器上的ProtScale 软 件 （http：//us.expasy.org/cgi－bin/protscale.pl）对蛋白序列进行疏水性分析；利用Wo LF PSORT 软件（http：//wolfpsort.org/）对该蛋白的亚细胞定位进行分析。

1.2.4 荧光实时定量PCR 选择血吸虫看家基因tubulin作为内参。将提取的7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d虫体总RNA，去除基因组DNA后反转录为cDNA，采用荧光染料法进行实时定量PCR检测。利用Beacon Designer软件设计Sj TOM34和tubulin基因的实时定量PCR引物，其中SjTOM34实时定量PCR的上游引物为5′－GCCGTCTCATGCCATAGC－3′，下 游 引 物 为 5′－AGCATCGTCTGTGTAGTCTAAC－3′，扩增片段为163 bp；tubulin实时定量PCR的上游引物为5′－CTGATTTTCCATTCGTTTG－3′，下游引物为5′－GTTGTCTACCATGAAGGCA－3′，扩增片段为213 bp。PCR 反应体系为：2×SYBR Premix Ex TaqTM10μL，10 μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4 μL，dd H2O 8.2μL，cDNA模板1μL，共20μL。反应参数为：50℃2 min，95℃10 s，（95℃5 s；60℃34 s）40个循环，其中60℃34 s结束时间为荧光信号检测点，每个反应均进行3个重复。采用Mastercyclerep Realplex软件进行分析，分别计算出7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d雌虫和42 d的雄虫中SjTOM34相对于tubulin的含量。

1.2.5 重组表达质粒的构建 根据GenBank中的EST序列信息，设计该基因的扩增引物进行cDNA片段的扩增。上游引物：5′－CGCGTCGACATGAAACCTGAACAGATTT－3′，下划线处为SacI位点；下 游 引物：5′－TCCTCGAGCTAGTCTAAGTCTGGACATG－3′，下划线处为XhoI位点。以反转录得到的35 d虫体的cDNA为模板进行PCR扩增，得到引入SacI和XhoI酶切位点的SjTOM34基因ORF序列。将测序正确的序列定向克隆至原核表达载体p ET28a（＋），构建重组表达质粒p ET28a（＋）－SjTOM34，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。

1.2.6 重组蛋白的表达与纯化 将测序正确的p ET28a（＋）－SjTOM34/BL21接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养，至OD600为0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。应用SDS－PAGE电泳分析最佳诱导时间及表达形式后，通过Ni－NTA His Bind Resin对重组蛋白进行纯化及复性。

1.2.7 抗体的制备 选择6 w BALB/c进行皮下注射免疫，每次每只注射206佐剂和20μg纯化的重组SjTOM34蛋白的乳化液，其中重组蛋白SjTOM34与206佐剂以体积比46∶54的比例进行混合乳化。免疫间隔时间为2周，共免疫3次，第3次免疫后2周剖杀小鼠，收集血清，－20℃保存备用。

2 结 果

2.1SjTOM34的克隆及生物信息学的分析 在本实验室10 d童虫差异性表达蛋白质组学研究基础上，选择了一个EST序列进行进一步的研究。应用RT－PCR的方法扩增得到了一个与预期大小相符的特异基因片段，测序结果显示，NCBI上公布的序列在797位多了一个核苷酸“A”，从而使ORF的大小发生了改变。DNAStar分析表明该基因的ORF大小为1 083 bp，编码360个氨基酸，理论分子量为40.8 k D，理论等电点为4.94。该氨基酸序列的N端无信号肽，疏水区不明显。

将来自曼氏血吸虫（GenBank登录号ref｜XP＿002577521.1）、华支睾吸虫（GenBank登录号：dbj｜GAA28250.1）、蜥蜴（GenBank登录号：ref｜NP＿003221034.1）、原鸡 （GenBank 登录 号：ref｜XP＿001025928.1）、穴 兔 （GenBank 登 录 号：XP＿002710718.1）、黑 猩 猩 （GenBank 登 录 号：XP＿003311967.1）和 人 （GenBank 登 录 号：gb｜AAB38382.1）7个物种的TOM34蛋白序列进行多重比对，结果显示该基因编码的蛋白序列与曼氏血吸虫TOM34蛋白的氨基酸序列的相似性为78%，与华支睾吸虫的相似性为57%，与蜥蜴、原鸡、穴兔、黑猩猩、人的相似性分别为44%、44%、42%、40%、42%（见图1、图2）。

图1 不同物种TOM34蛋白序列的多重比对Fig.1 Comparison of the protein sequence of Sj TOM34 with those of the other species

2.2SjTOM34基因的期别、性别差异表达分析Real－time RT－PCR结果表明，SjTOM34基因在所检测的童虫及成虫各阶段虫体中均有表达，其中在35 d虫体的表达量最高，在其他时期虫体中的表达量较为接近，在42 d雌虫和雄虫中的表达无显著差别（图3）。

2.3 重组原核表达质粒p ET28a（＋）－SjTOM34的构建 经双酶切鉴定（图4）和测序鉴定后，证实了p ET28a（＋）－SjTOM34重组表达质粒的构建成功。

图2 不同物种TOM34蛋白的进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Sj TOM34 with its homologues

图3 实时定量PCR检测Sj TOM34基因在日本血吸虫不同期别、性别虫体中的表达情况Fig.3 Stage and gender differential expression of Sj TOM34 in S.japonicum by real－time RT－PCR7 d，14 d，21 d，28 d，and 35 d represent worms at 7 days，14 days，21 days，28 days，and 35 days，respectively.42 d（f）：female adult worms at 42 days；42 d（m）：male adult worms at 42 days.

图4 重组表达质粒pET28a（＋）－Sj TOM34的双酶切鉴定Fig.4 The recombinant plasmid identified by enzyme digestionM：DL2000 marker；1：p ET28a（＋）digested with Sal I and Xho I restriction enzyme；2：p ET28a（＋）－Sj TOM34 digested with Sal I and Xho I restriction enzyme

2.4 pET28a（＋）－SjTOM34的原核表达和重组蛋白的纯化 SDS－PAGE结果显示，重组原核表达质粒p ET28a（＋）－SjTOM34在大肠杆菌BL21中成功表达，重组蛋白的分子量约为45 k D，与预期结果相符。该重组蛋白在超声上清和沉淀中都有存在，经Ni－NTA树脂纯化后，可获得较纯的重组蛋白（图5）。

图5 SDS－PAGE分析pET28a（＋）－Sj TOM34/BL21的蛋白表达情况Fig.5 SDS－PAGE analysis of the expression of pET28a（＋）－Sj TOM34/BL21 in E.coli.M：Protein marker；Lane 1 and 2：Total extract of p ET28a（＋）before and after induction with 1 m M IPTG；Lane 3 and 4：Expression of recombinant plasmid p ET28a（＋）－Sj TOM34 before and after induction with 1 m M IPTG；Lane 5 and 6：Pellet and supernatant of expression product after lysis，respectively；Lane 7：Sj TOM34 purified through Ni2＋－charged column chromatography and after dialysis.

2.5 重组蛋白的抗原性分析 通过Western blotting检测，在45 k D呈现一明显的识别条带（图6），证明该重组蛋白具有良好的抗原性。对SjTOM34基因在不同期别虫体内蛋白表达水平的Western blotting检测显示，该蛋白在不同时期虫体内都存在（图7）。

图6 重组蛋白Sj TOM34的Western blotting分析Fig.6 Western blotting analysis of pET28a（＋）－Sj TOM34M：Prestained protein marker；Lane 1：Purified recombinant Sj TOM34 protein was recognized with mouse serum against Sj TOM34.

图7 不同时期虫体中Sj TOM34蛋白的Western blotting分析Fig.7 Western blotting analysis of the protein extracts from S.japonicum at different stages7 d，14 d，21 d，28 d，35 d and 42 d represent worms at 7 days，14 days，21 days，28 days，35 days and 42 days，respectively.

2.6SjTOM34蛋白在虫体内的免疫组化分析在荧光显微镜下可以观察到Cy3标记的山羊抗小鼠IgG二抗发出的红色荧光以及DAPI复染核酸后发出的蓝色荧光，实验结果表明，该蛋白广泛分布在虫体内部的实质组织中（图8）。

图8 Sj TOM34蛋白在21 d日本血吸虫虫体内的定位分析（10×40）Fig.8 The localization analysis of Sj TOM34 by immunofluorescence in 21－day－old worms（10×40）

3 讨 论

在我国，日本血吸虫可以感染40多种哺乳动物，山羊、黄牛、绵羊、兔子和小鼠等都是其易感宿主，另外一些哺乳动物如大鼠等是日本血吸虫的不易感宿主。在不易感宿主体内，血吸虫的发育率低而且虫体较小［10－11］。东方田鼠是目前为止发现的唯一一种对日本血吸虫具有抗性的宿主，日本血吸虫尾蚴可以感染东方田鼠，感染之后虫体发育迟缓，在感染尾蚴15 d后，东方田鼠体内基本上找不到存活的虫体［12－13］。不同的宿主为日本血吸虫提供不同的生存环境，影响到虫体的生存和发育。不同宿主环境中生长的虫体在蛋白表达上也存在一定的差异，而这些差异表达的蛋白可能是虫体生存发育所需要的关键分子。在本实验室之前的研究中发现，SjTOM34蛋白在小鼠来源10 d童虫中的含量明显高于大鼠和东方田鼠来源的10 d童虫的含量，因此对这种在不同易感性宿主环境中日本血吸虫生长发育差异的蛋白作进一步的研究具有理论意义，同时也可为血吸虫新药靶和疫苗候选分子筛选提供基础。

TOM34是一种在哺乳动物细胞内发现的线粒体外膜转运结构蛋白，该蛋白包含3个TPR结构，通过TPR结构识别前体蛋白，与前体蛋白的成熟区域相结合，进而调节前体蛋白进出入线粒体。Chewawiwat等［8］发现在哺乳动物细胞中TOM34大量存在于胞质中，线粒体膜上也有部分存在，并且TOM34是线粒体外膜输入机制的重要组成成分，在线粒体前体蛋白进入线粒体的过程中发挥着重要的作用。同时他们还发现，在体外抗TOM34的抗体和缺乏N端疏水序列的TOM34能强烈阻止前体蛋白进入大鼠的线粒体内。Mukhopadhyay等［9］认为重组表达的人TOM34蛋白能够与胞质中线粒体前体蛋白的成熟区域发生相互作用，使这些蛋白能够保持一种未折叠的状态，从而能够更容易地进入线粒体内，但是它不能与前体蛋白的引导序列结合。Yang等［14］利用酵母双杂交技术筛选能够与人TOM34结合的蛋白，结果发现胞质中的TOM34首先与ATP酶相关的缬酪肽包含蛋白（VCP）和溶酶体H＋运输ATP酶膜蛋白 M（ATP6M）相结合，它们能够形成一个400 k D的复合物，而201－256的TPR基序能够与其它蛋白相结合，并且他们认为TOM34似乎不是线粒体外膜转移蛋白家族中的一员，而是在蛋白转移至线粒体过程中具有伴侣样功能的蛋白分子。Shimokawa等［15］通过cDNA芯片发现，TOM34基因在人的结肠癌细胞中表达上调，对结肠癌细胞HCT116的TOM34基因进行RNA干扰后，能够有效的抑制该基因的表达并且抑制该细胞的生长，其可以作为一种潜在的诊断抗原或抗结肠癌的药靶。Faou等［6］发现，TOM34能够作为一个伴侣分子与热激蛋白70（Hsp70）和热激蛋白90（Hsp90）形成一个胞质复合物，从而使线粒体前体蛋白能够进入线粒体，当TOM34过量、Hsp70和Hsp90不足的时候，线粒体的前体蛋白进入线粒体的数量是不会增加的，并且TOM34具有结合以TOM70转移途径进入线粒体的前体蛋白的能力。上述的这些研究结果都说明了TOM34在前体蛋白进入线粒体的过程中以及对细胞正常的生长都具有重要的作用。

本实验所克隆的SjTOM34基因经过生物信息学分析，发现该序列未含有信号肽，在胞质和细胞核中都可能存在，这与之前报道的哺乳动物TOM34蛋白所在位置的结果较为一致。而同源性比对和系统进化树的分析结果显示，日本血吸虫TOM34与曼氏血吸虫的同源性较高，而与人和其它哺乳动物的同源性较低，这为将来以该蛋白作为新药物靶标或疫苗候选分子的可能性提供了一定的理论基础。通过实时定量和Western blotting分析发现，TOM34基因在日本血吸虫各个发育阶段都有表达且表达水平相对稳定，这可能与该蛋白在转移线粒体蛋白进入线粒体内这一过程中的重要作用有关。而本实验室之前研究发现日本血吸虫童虫在非适宜和抗性宿主中生长状况不好，可能与该蛋白在这两种宿主来源虫体中的含量低，影响了寄生虫正常的蛋白合成与代谢有一定关系。同时 Western blotting的结果表明该重组表达产物具有良好的免疫原性，可以诱导BALB/c小鼠特异性抗体的产生。而免疫组化实验表明，该蛋白广泛分布在虫体的实质组织中，可能对虫体各种细胞线粒体前体蛋白的正常代谢都会起到一定的作用。

本研究首次克隆、原核表达了SjTOM34基因，分析了该基因在日本血吸虫不同期别和性别虫体中的表达情况，发现该蛋白主要分布在虫体的实质组织中，并且重组的SjTOM34蛋白是具有良好免疫原性的。本文为深入研究该基因在血吸虫生长发育中的生物学功能及其作为抗日本血吸虫病候选疫苗分子或药物靶标的潜力奠定了基础。

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