利用响应面法优化出芽短梗霉As3．933产普鲁兰多糖发酵培养基

常 帆，薛文娇，安 超，马赛箭

（陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心，陕西 西安710043）

普鲁兰多糖（Pullulan），又称茁霉多糖、短梗霉多糖等，是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵产生的一类多聚糖［1］，为右旋葡聚糖［2］。普鲁兰多糖是由麦芽三糖通过α－1，6－糖苷键连接形成的高分子量的线形多糖［3］，其中α－1，4－糖苷键与α－1，6－糖苷键的比例为2∶1，聚合度为200～5000，平均分子质量为4．8×104～2．2×106Da［4］。普鲁兰多糖因其易溶于水、不凝胶化、可以任意加工成型、无毒性等特点应用于食品、医药、化工等诸多行业［5，6］，尤其是作为食品添加剂应用广泛［7］。

利用出芽短梗霉发酵产普鲁兰多糖时，碳源、氮源、营养因子、溶解氧水平、温度和pH值等因素都影响其形态特征和产物的形成［8］。作者借助统计学软件Design－Expert 8．0，采用响应面设计法（RSM）对影响普鲁兰多糖产量的主要培养基参数进行优化，以期为生产中提高普鲁兰产量提供依据。

1 实验

1．1 菌种与培养基

出芽短梗霉As3．933，中国科学院普通微生物保藏中心。

PDA固体培养基（g·L－1）：马铃薯200．0，葡萄糖20．0，琼脂20．0。

液体种子培养基（g·L－1）：葡萄糖50．0，酵母膏2．5，NaCl 1．0，MgSO4·7H2O 0．2，K2HPO45．0，（NH4）2SO40．6，pH 值6．5。

液体发酵培养基（g·L－1）：蔗糖50．0，酵母膏2．5，NaCl 1．0，MgSO4·7H2O 0．2，K2HPO45．0，（NH4）2SO40．6，pH 值6．5。

以上培养基均于115℃灭菌30min。

1．2 方法

1．2．1 出芽短梗霉种子培养

从保藏斜面挑取一环出芽短梗霉As3．933菌种接种于装有50mL液体种子培养基的锥形瓶中，于230r·min－1、28℃培养48h。

1．2．2 发酵培养产普鲁兰多糖

将种子液以5%（2．5mL）接种量接入装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，于230r·min－1、28℃培养120h。

1．2．3 生物量和多糖含量的测定

将发酵液于6000r·min－1离心15min，沉淀用水洗涤2次后，105℃烘干至恒重。向上清液中加入2 BV无水乙醇，振荡摇匀，4℃放置12h，10 000r·min－1离心5min，沉淀于80℃烘干至恒重，即得普鲁兰多糖粗品，称量。

1．2．4 Plackett－Burman实验设计

根据单因素实验结果，以粗普鲁兰多糖产量为指标进行Plackett－Burman实验设计。选择实验次数N＝12，对蔗糖（X1）、（NH4）2SO4（X2）、酵母膏（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、NaCl（X5）、K2HPO4（X6）和pH值（X7）7个因素进行考察，另外取4个虚拟项进行误差估计。每个因素取2个水平，高水平编码为＋1，低水平编码为－1。各因素水平取值见表1。以普鲁兰多糖产量为响应值，每组3个平行，取平均值。用Design－Expert 8．0进行数据处理。

表1 Plackett－Burman实验因素与水平／g·L－1Tab．1 Factors and levels of Plackett－Burman experiment／g·L－1

1．2．5 最陡爬坡实验

最陡爬坡实验以Plackett－Burman（PB）实验的实验值变化方向为爬坡方向，根据PB实验结果设计步长，尽快逼近最大响应区域。

1．2．6 响应面分析

在最陡爬坡实验结果的基础上进行3因素3水平实验，利用Design－Expert 8．0软件优化培养基组成。

2 结果与讨论

2．1 Plackett－Burman设计方案与结果

Plackett－Burman实验设计及结果见表2，各因素效应及显著性分析见表3。

由表3可知，对普鲁兰多糖产量产生正效应的因素为蔗糖、MgSO4·7H2O、NaCl和 K2HPO4，产生负效应的因素为（NH4）2SO4、酵母膏和pH值。而可信度在95%水平上时酵母膏、（NH4）2SO4和 K2HPO4差异显著。

2．2 最陡爬坡实验

Plackett－Burman 实 验 结 果 表 明，（NH4）2SO4（X1）、酵母膏（X2）为负效应，K2HPO（X3）4为正效应根据效应大小决定步长、其它因素分别取中心点水平，进行最陡爬坡实验。最陡爬坡实验设计与结果见表4。

表2 Plackett－Burman实验设计与结果Tab．2Design and results of Plackett－Burman experiment

表3 Plackett－Burman实验结果分析Tab．3Significance analysis of Plackett－Burman experiment

表4 最陡爬坡实验设计与结果Tab．4 Design and results of the steepest ascent experiment

由表4可知，（NH4）2SO40．65g·L－1、酵母膏2．6g·L－1、K2HPO47．05g·L－1时普鲁兰多糖产量最高，因此将第2组作为Box－Behnken的中心点进行进一步优化。

2．3 Box－Behnken实验设计和响应面分析

根据Plackett－Burman实验和最陡爬坡实验确定的中心点，以普鲁兰多糖产量（Y）为响应值对普鲁兰多糖的发酵培养基进行3因素3水平的Box－Behnken实验，实验的因素和水平见表5，设计和结果见表6。

表5 Box－Behnken实验因素与水平／g·L－1Tab．5Factors and levels of Box－Behnken experiment／g·L－1

用 Design－Expert 8．0软件对 Box－Behnken实验结果进行二次回归分析，得到的回归方程为：Y＝21．6313＋1．3188 X1＋1．9666 X2－0．7932 X3－2．076－1．5833－1．5943－1．2165 X1X2＋1．6225 X1X3＋1．3133 X2X3。

表6 Box－Behnken实验设计与结果Tab．6Design and results of Box－Behnken experiment

二次响应模型的方差分析结果见表7。

表7二次响应模型方差分析Tab．7 ANOVA for the secondary response model

模型的复相关系数的平方R2＝96．32%，说明回归方程的拟合程度良好，失拟较小。由表7可知，3个自变量和因变量之间线性关系显著（P＜0．05），其中X2对Y值的影响达到极显著水平；从交互作用来看，X1与X3交互作用显著，而X1与X2、X2与X3之间的交互作用不显著，表明因素对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系，这和模型回归中的线性、平方和交互性影响显著相对应。其中失拟项的P＝0．333（＞0．05），没有显著性影响，说明数据没有异常点，模型适当。

根据Box－Behnken实验结果绘制三维响应面图（图1），可以看出该设计有最大值。利用Design－Expert 8．0软件响应优化器进行放大，最大值处为：（NH4）2SO40．67g·L－1、酵母 膏 2．84g·L－1、K2HPO47．12g·L－1，在此条件下，普鲁兰多糖的理论最大产量为22．29g·L－1。采用上述优化发酵培养基进行3组平行实验，实际测得的普鲁兰多糖产量分别为22．58g·L－1、21．98g·L－1、22．32g·L－1，平均值为22．29g·L－1，与预测值一致，说明基于响应曲面法所得到的出芽短梗霉发酵培养基参数准确可靠，具有实用价值。

图1 各因素之间交互影响普鲁兰多糖产量的响应面和等高线图Fig．1 Response surface and contour plots showing the effects of three variables on production of pullulan

3 结论

在单因素实验的基础上，利用Plackett－Burman实验筛选出影响菌株As3．933产普鲁兰多糖发酵培养基的3个主要因素：酵母膏、（NH4）2SO4和 K2 HPO4，再利用最陡爬坡实验逼近最大影响区域，最后通过Box－Behnken实验优化发酵培养基，确定最佳培养基组成为：蔗糖62．5g·L－1，（NH4）2SO40．67g·L－1，酵母膏2．84g·L－1，K2HPO47．12g·L－1，NaCl 1．25g·L－1，MgSO4·7H2O 0．25g·L－1，pH值6．5。优化后的普鲁兰多糖产量达到22．29g·L－1，较初始液体发酵培养基（17．32g·L－1）提高了28．70%。

［1］Ronen M，Guterman H，Shabtai Y．Monitoring and control of pullulan production using vision sensor［J］．Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2002，51（3）：243－249．

［2］Ian W S．Polysaccharases for microbial exopolysaccharides［J］．Carbohydrate Polymers，1999，38（4）：319－328．

［3］Singh R S，Saini G K．Production，purification and characterization of pullulan from a novel strain of Aureobasidium pullulans FB－1［J］．Journal of Biotechnology，2008，136（S）：506－507．

［4］Cheng K C，Demirci A，Catchmark J M．Pullulan：Biosynthesis，production，and applications［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2011，92（1）：29－44．

［5］Singh R S，Saini G K．Pullulan－hyperproducing color variant strain of Aureobasidium pullulans FB－1newly isolated from phylloplane of Ficus sp．［J］．Bioresource Technology，2008，99（9）：3896－3899．

［6］付湘晋，童群义．普鲁兰多糖的研究［J］．食品研究与开发，2005，26（6）：16－21．

［7］GB 28402－2012，食品安全国家标准 食品添加剂 普鲁兰多糖［S］．

［8］汤兴俊，何国庆．茁霉多糖的微生物发酵及在食品工业中的应用［J］．粮油加工与食品机械，2002，56（7）：34－36．