细菌感染对斑马鱼TLR5表达的影响研究

欧阳蒲月，黄智璇

（广东食品药品职业学院，广东 广州510520）

Toll样受体家族（TLRs）蛋白均由富含亮氨酸（LRRs）的胞外区和包含 Toll／IL－1样同源区（TIR）的胞内区组成［1］。其中Toll样受体5（TLR5）可在单核细胞、未成熟树突状细胞及上皮细胞中表达，是一种参与免疫应答的受体，在人类和小鼠中其具体作用是识别鞭毛蛋白并激活 NF－κB 介导的免疫反应［2］。TLR5和TLR4一起，可以识别鞭毛蛋白并激活干扰素调节因子3（IRF－3）［3］。在鱼类中 TLR5是保守的，已经在河豚（Fugu rubripes）、斑马鱼（Danio rerio）、虹鳟鱼（Rainbow trout）中证实了 TLR5分子的存在［4］。

TLRs在鱼类中的功能与在哺乳动物中有些差异：（1）在大部分的鱼类中，不仅存在与人类同源的TLR5分子，还有一种哺乳动物中没有的可溶的TLR5（TLR5S）；（2）TLR4在硬骨鱼中并不是普遍存在的，有些鱼类（如河豚）中就没有TLR4；（3）有一些TLRs分子是鱼类特有的，例如 TLR21、TLR22、TLR14，目前认为这同鱼类特殊的生活环境有关［5］。

作者对硬骨鱼类中的斑马鱼的TLR5在受到杀鲑气单胞菌（革兰氏阴性菌，G－）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌，G＋）刺激之后的表达变化进行了研究，旨在探讨TLR5对于斑马鱼天然免疫的重要意义。

1 实验

1．1 实验动物、菌株与引物

成体斑马鱼，野生型，实验室繁殖一代以上。

杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

TLR5 上 游 引 物：5′－CGAATCTCTTCAGCACCCTC－3′，TLR5下游引物：5′－CTGGCACACGTCACATCCTC－3′。

1．2 方法

1．2．1 感染用杀鲑气单胞菌和金黄色葡萄球菌的准备

接种杀鲑气单胞菌／金黄色葡萄球菌单克隆于5mL营养肉汤培养基中，28℃／37℃摇床培养过夜（8～10h）。再按1∶50的比例接种于营养肉汤培养基中，放大培养至对数期（2～3h）。6000r·min－1离心收菌，用无菌的PBS重悬洗涤。最后溶于PBS至一定浓度。将菌液倍比稀释后涂LB平板，计算菌落数，确定菌液终浓度。

1．2．2 斑马鱼感染

首先在斑马鱼培养液中添加丁香酚至160μg·mL－1进行麻醉，用无菌解剖刀刮伤斑马鱼侧面胸鳍至真皮层（面积约1mm2）。

杀鲑气单胞菌感染：将实验组的斑马鱼放入200mL 1×106CFU·mL－1的杀鲑气单胞菌溶液中浸泡（对照组为清水）15h，取实验组和对照组斑马鱼（各3条）的内脏组织混合提取RNA。

金黄色葡萄球菌感染：采用腹腔注射法。每条质量约1g的斑马鱼注射3×106CFU·mL－1金黄色葡萄球菌。对照组注射50μL PBS。

1．2．3 实验样品的获取

将感染后的斑马鱼作为实验组，分别于1h、4h、15h、24h提取5条全鱼的混合RNA，同时取相同时间点的未感染斑马鱼的RNA作为对照。用反转录试剂盒合成cDNA一链作为RT－PCR的模板。

1．2．4 实时定量RT－PCR

总RNA的提取：按Trizol试剂盒说明书的步骤依次加入Trizol提取液、氯仿、异丙醇，提取总RNA。用紫外分光光度仪分别测定260nm和280nm处的光密度值，确定RNA含量和纯度。

cDNA的合成：按TOYOBO产品说明书推荐的方法合成cDNA第一条链。在0．2mL EP管中分别加入总 RNA 3μg、Oligo（dT）18 50pmol、dNTP 20 nmol、5×缓冲溶液4μL、Rnasin 1μL、酶200μL（5U·μL－1）和DEPC水，反应体系总体积为20μL。逆转录条件为：42℃1h，70℃10min。

PCR反应体系为：cDNA 1．5μL，上、下游引物各5μL，QuantiTetTM SYBR Green PCR Kit提供的2× QuantiTetTM SYBR Green PCR Master Mix 12．5μL，用去离子水（ddH2O）将总体积补至25μL。在 ABIPRISM 7700（PE Applied Biosystems，Foster City，CA）定量PCR仪上按以下条件扩增：95℃15s，58℃15s，72℃30s，共40个循环，同时记录溶解曲线。

1．2．5 数据的收集及统计学的处理

每组扩增3个平行样品，取平均值，根据内参（β－Actin）消减试验不平衡误差，默认扩增效率统一为2，计算斑马鱼感染前后目的基因表达量的相对变化并绘制柱形图。

2 结果与讨论

2．1 PCR结果

斑马鱼感染杀鲑气单胞菌（G－）、金黄色葡萄球菌（G＋）后TLR5表达的变化见图1。

由图1可知，斑马鱼感染G＋和G－细菌后，TLR5表达都不同程度出现了上调。斑马鱼感染杀鲑气单胞菌后4h，TLR5表达开始出现上调，至15h达到峰值，升幅243．8倍（223．6～250），然后迅速回落。同样，斑马鱼感染金黄色葡萄球菌后，TLR5表达上调更迅速，在4h即出现峰值，升幅208．3倍（189．7～226．9），随后逐步回落。TLR5在人类和小鼠中都是识别鞭毛蛋白的模式受体，从本研究结果可以看出，G＋和G－细菌的感染都诱发了TLR5表达的上调，即使是完全没有运动能力、不具有鞭毛的金黄色葡萄球菌也可以诱发TLR5表达的上调。

图1 斑马鱼感染杀鲑气单胞菌和金黄色葡萄球菌后TLR5的表达变化Fig．1 Change of expression of TLR5when zebrafish was infected with Aeromonas salmonicida（G－ ）and Staphylococcus aureus（G＋ ）respectively

2．2 讨论

细菌根据革兰氏染色结果的不同可以分为革兰氏阳性菌（G＋）和革兰氏阴性菌（G－），这两类细菌结构不同，作为感染源时的致病成分也不同，例如革兰氏阴性菌的致病成分LPS在革兰氏阳性菌中不存在，革兰氏阳性菌主要是靠LTA来激活免疫反应。

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要组成部分，很多的病原微生物，包括大部分革兰氏阴性菌和小部分革兰氏阳性菌都具有鞭毛，虽然G＋和G－的鞭毛结构有些细微的差别，但都能激活天然免疫反应。研究证明TLR5可以通过识别恒定结构域D1（位于蛋白中间部位的α螺旋链）来鉴别鞭毛蛋白。

杀鲑气单胞菌是革兰氏阴性菌，无芽孢，兼性厌氧杆菌，属弧菌，主要引起鱼类的疖疮病，即体表皮肤出现疖疮，疖疮破皮而出形成溃疡，解剖后可见典型的败血症症状。金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染，有“嗜肉菌”的别称，无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。

本研究发现，用具有鞭毛的杀鲑气单胞菌感染斑马鱼后，可以使TLR5的表达量在感染后15h达到243．8倍的峰值，这说明TLR5在斑马鱼中也是识别鞭毛蛋白的。但是用不具有鞭毛的金黄色葡萄球菌感染斑马鱼后也可以诱发TLR5表达的上调。

考虑到斑马鱼的生存环境，频繁接触外源微生物，它需要强大的免疫系统来保护自己。目前已知鱼类与哺乳动物在免疫系统上有很多差异，虽然斑马鱼属于脊椎动物，已经具备较为完善的适应性免疫系统和强大的固有性免疫系统，但是仍然存在很大的差距。例如，鱼类非常重要的一点就是对于LPS不敏感。LPS是一种内毒素，是细胞壁组分中最有效的免疫兴奋剂。LPS的组成部分类脂A则是大部分G－细菌感染中出现的病理现象（如内毒素性休克）的主要致病因子。在哺乳动物中，LPS侵入后可以与LPS结合蛋白（LBP）结合，募集CD14和MD－2，复合体能够被TLR4识别，激活免疫信号［6，7］。但是鱼类却可以对LPS高度耐受，具体的原因至今仍在探索。另外鱼类的Toll样受体家族中也发现了不少在哺乳动物中不存在的新成员，如 TLR5S、TLR20、TLR21等等［5］，这也使得鱼类的固有性免疫更加完善和强大。

鱼类的致病菌大部分是革兰氏阴性菌，这类细菌大多带有鞭毛和LPS，鱼类为了生存，对日常生活中过于频繁接触的LPS高度耐受，TLR5可能就是鱼类抵抗革兰氏阴性菌的核心策略。鞭毛的作用是为了细菌的运动，所以数量很少，大部分只有1～4根，数量有限，不像LPS那样遍布细菌的整个细胞膜。具有鞭毛的革兰氏阴性菌可以直接激活TLR5通路，从而帮助斑马鱼抵御革兰氏阴性菌，又不至于引起过于激烈的免疫反应。

因此认为TLR5是斑马鱼天然免疫防御的核心。不具有鞭毛的革兰氏阳性菌可能是先激活Toll样受体家族的其它通路，再诱导TLR5表达的活跃，协同抵御外源微生物的入侵。具体的调控机制尚需要进一步的研究。

3 结论

Toll样受体家族（TLRs）在天然免疫中发挥着重要作用。用杀鲑气单胞菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）分别感染斑马鱼后，检测了斑马鱼TLR5表达的变化。结果表明，具有鞭毛的杀鲑气单胞菌和不具有鞭毛的金黄色葡萄球菌均可以诱导TLR5表达的上调。认为具有鞭毛的杀鲑气单胞菌可以直接激活TLR5通路，而不具有鞭毛的金黄色葡萄球菌可能是先激活了Toll样家族的其它通路后再诱导TLR5表达的上调，从而推断TLR5是斑马鱼天然免疫的核心。

［1］Akira S，Takeda K．Toll－like receptor signaling［J］．Nat Rev Immunol，2004，4（7）：499－511．

［2］Hayashi F，Smith K D，Ozinsky A，et al．The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll－like receptor 5［J］．Nature，2001，410（6832）：1099－1103．

［3］Mizel S B，Honko A N，Moors M A，et al．Induction of macrophage nitric oxide production by Gram－negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll－like receptor 5／Toll－like receptor 4 complexes［J］．J Immunol，2003，170（12）：6217－6223．

［4］Tsujita T，Ishii A，Tsukada H，et al．Fish soluble Toll－like receptor（TLR）5amplifies human TLR5response via physical binding to flagellin［J］．Vaccine，2006，24（12）：2193－2199．

［5］Baoprasertkul P，Xu P，Peatman E，et al．Divergent Toll－like receptors in catfish （Ictalurus punctatus）：TLR5S，TLR20，TLR21［J］．Fish Shellfish Immunology，2007，23（6）：1218－1230．

［6］Poltorak A，He X，Smirnova I，et al．Defective LPS signaling in C3H／HeJ and C57BL／10ScCr mice：Mutations in Tlr4gene［J］．Science，1998，282（5396）：2085－2088．

［7］Shimazu R，Akashi S，Ogata H，et al．MD－2，a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll－like receptor 4［J］．J Exp Med，1999，189（11）：1777－1782．