家兔胆固醇酯转移蛋白基因克隆及其真核表达载体的构建

张 鹏，王艳丽，郭世文，刘恩岐

（1.西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西 西安 710061；2.西安医学院临床医学院，陕西 西安 710021；3.西安交通大学医学院实验动物中心，陕西 西安 710061）

心血管系统疾病（cardiovascular disease，CVD）是危害人类健康的主要疾病，是造成国人死亡的主要原因之一［1］。CVD的病理基础是动脉粥样硬化（atherosclerosis，As），而脂质代谢异常是As发生发展的重要危险因素。因此，对血脂异常的干预是预防冠心病、脑卒中和其他CVD的重要措施。对脂质异常进行治疗的目标是降低CVD患者低密度脂蛋白（low－density lipoprotein，LDL）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平，升高高密度脂蛋白（high－density lipoprotein，HDL）［2－3］水平。在升高HDL水平药物开发中，胆固醇酯转移蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）抑制剂的研究引起了广泛关注。人CETP是一个极度疏水的糖蛋白，包含476个氨基酸，其中非极性氨基酸占45%，在胆固醇逆转运中，CETP能够促进胆固醇酯从HDL转运到含载脂蛋白B（apoB）的脂蛋白颗粒中，同时反向转运TG，抑制CETP可能能够增加血液HDL水平的升高。近年来CETP因参与血浆脂蛋白胆固醇水平的调控和脂蛋白颗粒的重塑，在脂蛋白代谢中的作用倍受重视［4］。但是，CETP究竟是抗As因子还是致As因子一直存在争议［5］。家兔体内LDL含量高，脂蛋白的特征与人相似，血浆中富含CETP，高胆固醇饲料容易诱发家兔As，是目前研究人As应用最广泛的动物模型之一［6－7］。本研究通过家兔 CETP基因的克隆、序列分析及构建真核表达载体，为进一步研究CETP的结构与功能、阐明CETP在As发生发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂与仪器 ①实验用家兔：由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK（陕）2008－008，取材前对家兔实行安乐死。②主要试剂：TRIzol（Invitrogen公司）；逆转录试剂盒、LA Taq酶、KpnⅠ和XbaⅠ内切酶、T4DNA连接酶及克隆用pMD19－T载体（TaKaRa大连宝生物公司）；DNA片段回收试剂盒、异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷（X－gal）、LB培养基胰蛋白胨、酵母提取物、质粒提取和纯化试剂盒及琼脂糖（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；引物由TaKaRa大连宝生物公司合成；大肠杆菌DH5α和pcDNA 3.1载体为西安交通大学研究生创新实验中心惠赠。③主要仪器：BIOFUGE PRIMO R低温离心机及超低温冰箱（美国Thermo公司）；DEC－810型PCR仪（东盛创新科技有限公司）；培清JS－680C凝胶图像分析系统（上海继锦化学科技有限公司）；培英 THZ－D恒温摇床（太仓实验设备厂）；eppendff分光光度仪（德国eppendff）；高压灭菌锅（厦门致徽仪器有限公司）水浴锅（天津泰特斯科技有限公司）。

1.2 克隆家兔CETP cDNA 家兔肝组织总RNA提取：①取新鲜家兔肝组织0.05～0.10g置于组织匀浆器中，加入预冷的TRIzol液1mL，在冰浴中迅速匀浆15～30s，将细胞悬浮液吸入另一个1.5mL Ep管中，室温下静置5min；②加入200μL氯仿，剧烈振摇15s混匀，室温静置3min；③4℃、10000r· min－1离心 15min，RNA分布于水相中；④将上层无色水相转移到另一个Ep管中，加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；⑤4℃、10000r·min－1离心10min；⑥弃上清液，用1mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃、7500r·min－1离心5min；⑦弃上清液，室温干燥5min；⑧向干燥过的沉淀物中加入100μL DEPC处理水溶解沉淀物，于－80℃保存备用。⑨采用eppendff分光光度仪测总RNA浓度，将所测总RNA浓度调整为1g·L－1，用逆转录试剂盒逆转录为cDNA用于下一步克隆CETP。家兔CETP cDNA获得：①根据GenBank（M27486）中家兔CETP mRNA 序列设计引物：5′－GGAATTCCATATGTGCTCCAAAGGCACCTCGC－3′；5′－ACGCGTCGACGCTCAAGCTCTGGAGGAAATCCAC－3′。 ② 用 LA Taq 酶 进 行PCR反应：94℃、4min；94℃、55s，60℃ 、55s，72℃、2min，40个循环；最后72℃延伸10min，得到家兔PCR产物。③用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR目的片段，与GenBank中大小相符，用PCR纯化试剂盒回收。

1.3 CETP－pMD19－T载体的构建 ①建立10μL的反应体系（T4连接酶，缓冲液，pMD19－T载体，纯化回收的PCR产物），16℃、反应4h进行连接。②从大肠杆菌DH5α平板上挑取菌落，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞；③转化DH5α感受态细胞，涂布Amp／IPTG／X－Gal抗性平板，37℃过夜。挑白色菌落，摇菌，提取质粒。电泳鉴定CETP－pMD19－T重组情况。

1.4 CETP－pMD19－T测序及序列分析 取1个经电泳鉴定重组成功的CETP－pMD19－T送大连宝生物公司测序。CETP基因cDNA序列分析：①登陆NCBI与GenBank中登录号为M27486基因序列比对；②与gb｜AAA31199.1蛋白质序列比对；③采用nnPredict软件分析预测CETP蛋白二级结构。

1.5 CETP真核表达载体的构建 以CETP－pMD19－T为模板，设计引物5′－GGGGTACCATGGCCTGTCCCAAAGG－3′（包含 KpnⅠ酶切位点和起始密码子），5′－GCTCTAGAGTGGCTTAGCCGCTCAGCCAG－3′（包含 XbaⅠ酶切位点和终止密码子），进行PCR，PCR反应条件同1.2。将得到的CETP PCR产物电泳回收后，与pcDNA 3.1质粒同时进行KpnⅠ和XbaⅠ双酶切。将酶切后的PCR产物胶回收与载体连接，转化入大肠杆菌进行扩增。小量提取质粒进行KpnⅠ和XbaⅠ双酶切电泳鉴定。

2 结 果

2.1 CETP cDNA的克隆 用TRIzol法从家兔肝组织提取总RNA，采用RT－PCR方法逆转录为cDNA，以cDNA为模板，用LA Taq酶进行RT－PCR扩增，克隆出CETP基因，电泳片段与预计结果相符。见图1。

图1 CETP基因PCR扩增产物的电泳图Fig.1 Electrophoregram of amplification product of CETP gene by PCR

2.2 CETP－pMD19－T 载体的构建 将pMD19－T载体和纯化回收的CETP进行连接，转化DH5α感受态细胞，涂布 Amp／IPTG／X－Gal抗性平板，37℃过夜。挑白色菌落，摇菌，提取质粒。电泳鉴定CETP－pMD19－T重组成功。见图2。

图2 CETP与pMD19－T载体重组质粒电泳图Fig.2 Electrophoregram of recombinant plasmid of CETP and pMD19－T vector

2.3 CETP序列分析 CETP基因cDNA全长为1659bp，登陆NCBI，用所测CETP基因序列与GenBank中登录号为M27486基因序列比对，结果显示98%相符。

2.4 CETP基因序列比对 登陆NCBI，用所测CETP基因序列与gb｜AAA31199.1蛋白质序列比对，结果显示99%相符。

2.5 采用nnPredict软件分析预测CETP二级结构 CETP二级结构以α螺旋结构为主，相对分子质量为142119.4，pI为4.91。CETP结构基因编码序列（CDs区）长1494bp，编码498个氨基酸。

2.6 CETP真核表达载体的构建 将CETP PCR产物电泳回收后，与pcDNA 3.1质粒同时进行KpnⅠ和XbaⅠ双酶切。将酶切后的PCR产物胶回收与pcDNA3.1载体连接，转化入大肠杆菌进行扩增，小量提取质粒进行双酶切，可见pcDNA 3.1载体长度约为5400bp，CETP基因长度约为1600bp（图3），PCR鉴定可见 CETP PCR产物长度约为1600bp。见图4。

3 讨 论

图3 重组质粒CETP－pcDNA 3.1的双酶切电泳图Fig.3 Electrophoregram of CETP－pcDNA3.1recombinant plasmid digested by double restriction endonuclease

图4 重组质粒CETP－pcDNA 3.1PCR鉴定电泳图Fig.4 Electrophoregram of CETP－pcDNA3.1recombinant plasmid identified by PCR

CETP是一个参与脂质代谢的重要蛋白，但目前其在As中的确切功能还存在争议。在胆固醇逆转运中，HDL颗粒内的胆固醇酯被CETP转运到含apo B的脂蛋白中，随后这些脂蛋白被肝吸收分解，由于促进了外周组织多余胆固醇向肝的运送，避免了胆固醇在血管内的富集，CETP被认为具有抗As作用［8－9］。然而，另一方面，这个过程直接导致了HDL胆固醇水平的下降，因此CETP又被认为是促As的［10］。大量的流行病学及动物实验结果表明：CETP的作用可能随着代谢环境和遗传背景的改变而改变。目前，尽管人们已经获得了CETP的几种抑制剂，但CETP在As中的确切功能仍有待研究［11］。近年来，CETP基因单核苷酸多态性及其相应的表型效应成为国内外学者研究的热点［12－13］，本实验室研究［14］结果也显示：CETP TaqIB基因多态性与国人冠心病有密切关联，这对于在分子水平上阐明CETP的生理功能及其与临床疾病的关系具有十分重要的意义。

CETP在胆固醇逆转运过程中起着非常重要的作用，因此进一步分析CETP在As中作用机制是非常重要的。本研究成功克隆了家兔CETP基因序列，通过nnPredict软件分析预测CETP蛋白二级结构以α螺旋结构为主，相对分子质量为142119.4，pI 为 4.91。通过与GenBank中人CETP基因比对，证实了家兔CETP基因与人CETP基因结构非常相似。本研究成功构建了家兔CETP基因真核表达载体，为研究CETP基因多态性和蛋白的结构及功能奠定了基础，并为进一步研究人CETP基因在As等疾病中的确切效应提供了依据。

［1］He J，Gu D，Wu X，et al.Major causes of death among men and women in China ［J］.N Engl J Med，2005，353（11）：1124－1134.

［2］Baigent C，Keech A，Kearney PM，et al.Efficacy and safety of cholesterol－lowering treatment：prospective meta－analysis of data from 90，056participants in 14randomised trials of statins ［J］.Lancet，2005，366（9493）：1267－1278.

［3］Mazzone T. HDL cholesterol and atherosclerosis ［J］.Lancet，2007，370（9582）：107－108.

［4］Polk D，Shah PK.Cholesterol ester transfer protein（CETP）and atherosclerosis ［J］.Drug Discov Today Ther Strateg，2007，4（2）：137－145.

［5］Kappelle PJ，Perton F，Hillege HL，et al.High plasma cholesteryl ester transfer but not CETP mass predicts incident cardiovascular disease：a nested case－control study ［J］.Atherosclerosis，2011，217（1）：249－252.

［6］刘恩岐，范江霖.转基因兔在动脉粥样硬化中的应用及发展 ［J］.中国动脉硬化杂志，2003，11（4）：371－375.

［7］Wang Y，Cheng F，Chen Y，et al.High－dose rosiglitazone is proatherogenic in cholesterol－fed rabbits ［J］.Atherosclerosis，2012，222（1）：292－294.

［8］Oliveira HC，de Faria EC.Cholesteryl ester transfer protein：the controversial relation to atherosclerosis and emerging new biological roles ［J］.IUBMB Life，2011，63（4）：248－257.

［9］Sirtori CR. Investigational CETP antagonists for hyperlipidemia and atherosclerosis prevention ［J］.Expert Opin Investig Drugs，2011，20（11）：1543－1554.

［10］Barter PJ，Rye KA.Cholesteryl ester transfer protein inhibition as a strategy to reduce cardiovascular risk ［J］.J Lipid Res，2012，53（9）：1755－1766.

［11］Toth PP. CETP Inhibition： does the future look promising？［J］.Curr Cardiol Rep，2011，13（6）：559－565.

［12］李俊涛，郑克勤.胆固醇酯转运蛋白的基因多态性 ［J］.生命的化学，2008，28（2）.197－199.

［13］Sanders AE，Wang C，Katz M，et al.Association of a functional polymorphism in the cholesteryl ester transfer protein（CETP）gene with memory decline and incidence of dementia ［J］.JAMA，2010，303（2）：150－158.

［14］Yu Q，Liu E，Zhao S，et al.Association between TaqIB polymorphism of cholesteryl ester transfer protein and coronary artery disease in the Chinese population ［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2012，13（5）：342－347.