HIF－1α和RelA基因在急进高原正常人外周血单个核细胞中的表达及其与急性高原反应的关联性

方盼盼，宫璀璀，仓宝成，李正民，李宗杰，李文莉，朱传杰，王迎涛

（1.郑州大学第三附属医院科研中心，河南 郑州 450052；2.中国人民解放军153中心医院中心实验室，河南 郑州 450042）

急性高原反应（acute mountain sickness，AMS）的发生风险率与低氧环境和海拔高度上升的速度有着密切的关联性［1］。当海拔高度为4000m时，上升速度为91m·h－1，AMS的发生率为54%；上升速度为1268m·h－1，其发生率为73%；上升速度达到1647m·h－1时，其发生率增加 到 89%［2］。缺氧诱导因子（hypoxia－inducible factor，HIF）是在低氧状态下启动应激反应的重要转录因子，对于机体发育和某些疾病，如癌症、衰老和组织缺氧等均起着重要的作用［3］。目前研究［4］显示：对局部氧浓度敏感的转录因子基因已有20多种，其中的核转录因子 Kappa B（nuclear factor kappa B，NF－κB）在缺氧状态下可被激活。NF－κB家族由7个蛋白质亚基组成，包括RelA（p65）、RelB、c－Rel、NF－κB1（p105／p50）和NF－κB2（p100／p52），由5个不同的基因所编码，因此可以组成不同的异源或同源二聚体，起到调节NF－κB DNA的作用。在正常情况下，NF－κB经典信号传导通路中的p65／p50异二聚体处于无活性状态，当细胞受到细胞因子和缺氧刺激时，活化的p65／p50异二聚体进入细胞核，与结合位点结合，启动相关基因转录［4－5］。Oliver等［6］发现：低氧环境主要通过经典途径诱导NF－κB活化的增强。缺氧状态下，缺氧诱导因子1α（hypoxia－inducible factror－1α，HIF－1α）的表达水平受 NF－κB 直接调控［3］，而 HIF－1α对 NF－κB的表达存在一定的反馈作用［4］。但在急进高原缺氧状态下，HIF－1α与NF－κB蛋白质亚基RelA表达及与AMS的相关性研究尚未见报道。本研究通过观察急进4400m高原前后正常人外周血单个核细胞中 HIF－1α和RelA表达水平的变化，探讨急进高海拔地区对相关基因和蛋白的影响，为AMS的预防、诊断和治疗提供有价值的指导。

1 材料与方法

1.1 主要材料 逆转录试剂盒（Fermentas），鼠抗人多克隆抗体及抗鼠二抗试剂盒（Santa Cruz），Trizol（Invitrogen），PCR 试剂盒（TIANGEN），NF－κB、HIF－1α及内参引物由上海生工公司合成。

1.2 研究对象 2010年4月某部赴青海省玉树抗震士兵30名，其中男性23名，女性7名，年龄22～34岁，乘汽车急行军于24h内到达海拔4000m高度，48h抵达玉树。于出发前和到达玉树后分别采集外周静脉血，以枸橼酸钠抗凝。

1.3 单个核细胞的提取 采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，加入相当于单个核细胞悬液5倍体积的预冷PBS（每毫升PBS中加入磷酸酶抑制剂0.05mL，以限制进一步的蛋白质修饰）洗涤2次，176×g离心9min后弃去上清液，加入预冷的PBS将单个核细胞悬液的体积还原至1mL，采用血细胞分析仪计数单个核细胞数量。

1.4 细胞核蛋白和总RNA的提取 采用Trizol试剂提取细胞核蛋白和总RNA，所分离得到的单个核细胞在加入Trizol试剂后样品呈现匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

1.5 逆转录cDNA合成 Trizol试剂用异丙醇沉淀后，冰预冷DEPC处理水配制的75%乙醇1mL洗涤沉淀物，弃乙醇，室温干燥后将沉淀溶于适量DEPC水中，采用核酸定量仪检测RNA浓度，纯度达到要求后进行后续的实验。cDNA的合成采用反转录试剂盒，逆转录程序：25℃、5min，42℃、60min，70℃、5min，4℃缓冲30min。

1.6 RT－PCR 方法检测 HIF－1α和 RelA mRNA表达水平 将上述方法逆转录所得的cDNA作为模板，扩增目的基因片段。建立25.0μL的反应体系：cDNA 2.0μL，MasterMix 12.5μL，上下游引物的混合液1.0μL，ddH2O 9.5μL。设计引物：HIF－1α，sense 5′－AATGAAGTGTACCCTAACTAGCCG－3′，anti－sense 5′－GTTCACAAATCAGCACCAAGC－3′；NF－κB，sense 5′－AAGAAGCGGGACCTGGAGCA－3′，anti－sense 5′－GGGCACGATTGTCAAAGATGG－3′；β－actin，sense 5′－GAGCTACGAGCTGCCTGACG－3′，anti－sense 5′－CCTAGAAGCATTTGCGGTGG－3′。反应条件：95℃预处理5min；95℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃、5min；4℃缓冲60min。退火温度相同。应用凝胶成像系统Alpha Imager HP软件扫描HIF－1α和RelA mRNA及相应β－actin的RT－PCR电泳图，计算其均值与βactin内参照的比值。

1.7 Western blotting法检测 HIF－1α蛋白表达水平 应用Trizol提取各组蛋白质。采用Bradford法测定并调节各组总蛋白浓度。制备SDS－PAGE凝胶，电泳条件120V、2.5h。应用电转仪4℃下转移至硝酸纤维素膜（NCM）上，转膜条件58V、4h，将NCM与1∶1000稀释 的各种一抗室温下反应2h，再与1∶200稀释的二抗（鼠IgG－HRP）室温下反应1h。加入DAB底物溶液，显色20～30min，同时进行β－actin的内参照，阳性条带呈现棕色后用水终止反应。应用Image J免疫印迹处理学软件扫描，计算HIF－1α蛋白与内参蛋白灰度值比值。

1.8 AMS的判定 按照GB1098291《急性高原反应的诊断和处理原则》对进入玉树高原的士兵进行体检、询诊、诊断及确诊是否发生AMS。

1.9 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，HIF－1αmRNA和蛋白表达水平及RelA mRNA表达水平均符合正态分布，以表示，进入高原前后比较采用t检验；HIF－1α mRNA与 RelA mRNA 或 HIF－1α蛋白及 HIF－1α和RelA mRNA表达与AMS发生率的相关性分析采用Spearman相关分析法。

2 结 果

2.1 士兵急进海拔4000m高原后AMS发生率及发病程度 本组30名士兵中，有18例发生AMS，发生率为60.0%。其中轻度反应10例（55.6%），中度反应5例（27.8%），重度反应3例（16.7%）。

2.2 士兵急进高原前后外周血单个核细胞中HIF－1α和RelA mRNA表达水平 分离抗凝全血中单个有核细胞，提取总RNA，采用RT－PCR法检测单个核细胞中HIF－1α和RelA mRNA的表达水平。结果显示：与进入高原前比较，进入高原48h后RelA 和 HIF－1αmRNA表达水平明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01，见表1。

表1 急进高原前后士兵外周血单个核细胞中HIF－1α和RelA mRNA的表达水平Tab.1 Expression levels of HIF－1αand RelA mRNA in mononuclear cells of peripheral blood in soldiers before and after ascentting of plateau （n＝30，）

表1 急进高原前后士兵外周血单个核细胞中HIF－1α和RelA mRNA的表达水平Tab.1 Expression levels of HIF－1αand RelA mRNA in mononuclear cells of peripheral blood in soldiers before and after ascentting of plateau （n＝30，）

＊ P＜0.01compared with before ascentting.

mRNA RelA mRNA Before ascentting Group HIF－1α 0.458±0.155 0.815±0.126 After ascentting 1.377±0.314＊ 1.262±0.231＊

2.3 士兵急进高原前后外周血单个核细胞中HIF－1α蛋白表达水平 分离抗凝全血中单个有核细胞，提取蛋白质，采用Western blotting方法分析，结果显示：进入高原前HIF－1蛋白表达水平为0.84±0.13，进入高原后为0.99±0.12，进入高原后HIF－1蛋白表达水平上调（P＜0.01）。

2.4 不同性别士兵RelA mRNA 和 HIF－1α mRNA及蛋白表达水平的差异性 对不同性别组士兵外周血单个核细胞中HIF－1mRNA及蛋白表达水平、RelA mRNA表达水平进入高原前后的差值进行组间比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），表明性别对 RelA mRNA、HIF－1mRNA及蛋白表达水平无明显影响。见表2。

表2 不同性别士兵急进高原前后单个核细胞中HIF－1α mRNA及蛋白表达水平和RelA mRNA表达水平差值Tab.2 Differential values of expression levels of HIF－1α mRNA and protein and RelA mRNA in mononuclear cells before and after ascentting of plateau in different gender soldiers （n＝30，）

表2 不同性别士兵急进高原前后单个核细胞中HIF－1α mRNA及蛋白表达水平和RelA mRNA表达水平差值Tab.2 Differential values of expression levels of HIF－1α mRNA and protein and RelA mRNA in mononuclear cells before and after ascentting of plateau in different gender soldiers （n＝30，）

Group Differential value HIF－1αprotein HIF－1αmRNA RelA mRNA Male 0.18±0.15 0.86±0.38 0.44±0.26 Female 0.10±0.10 1.06±0.19 0.45±0.25

2.5 HIF－1αmRNA 和 RelA mRNA 表达水平的相关性分析 HIF－1αmRNA和Re1AmRNA表达水平均为正态分布，Spearman相关分析结果显示：相关系数（r）为0.806（P＜0.01），表明两者呈显著正关关系。

2.6 HIF－1αmRNA与蛋白表达水平的相关性分析 HIF－1αmRNA和蛋白表达水平均为正态性分布，但是散点图显示相关性不佳，Spearman相关分析结果显示：r＝0.081（P＞0.05），表明两者无相关性。

2.7 HIF－1α和RelA表达与AMS发生率相关性分析 将HIF－1α蛋白的检测结果与AMS发生率进行相关性分析，r＝0.875（P＜0.01），HIF－1α蛋白表达与 AMS发病程度高度相关。HIF－1α mRNA和RelA mRNA与AMS发生率之间的r分别为0.298（P＞0.05）和0.238（P＞0.05），表明不存在相关性。

3 讨 论

AMS是人体急进高原暴露于低氧环境后产生的各种病理性反应，常见症状有头痛、失眠、食欲减退、疲倦和呼吸困难等，且发病率较高［8］。当人从平原快速进入海拔3000m以上的高原时有50%～75%的人出现AMS，一般经3～10d习服后症状逐渐消失，病情严重者可引起脑水肿或肺水肿［9］。引起AMS的基础原因是低压性低氧，其发病机制尚不十分清楚。

HIF－1α是受低氧调控的HIF亚基，慢性低氧时，HIF－1α在机体对低氧的适应过程中发挥重要的核心作用，当HIF－1α的表达水平发生快速上调时，将对组织细胞产生严重的损伤。在正常的氧环境下，HIF－1α在脯氨酸羟化酶的作用下发生羟基化作用，然后与肿瘤抑制蛋白（von hippel lindau protein，pVHL）结合，募集泛素蛋白，组成泛素连接蛋白酶复合体发生泛素化作用，并通过蛋白酶体使 HIF－1α迅速降解。在低氧环境下，HIF－1α不发生羟基化，也不与pVHL结合，因此结构稳定的HIF－1α与其异聚体 HIF－1α结合在细胞核内进行基因转录，对缺氧缺血应激的适应基因进行转录调控［10－11］。本研究结果显示：与急进高原前比较，急进海拔4400m高原48h后，正常人外周血单个核细胞中HIF－1αmRNA和蛋白的表达量均显著增加。Steve等［12］报道：应用H2O2和活性氧ROS可诱导人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）中HIF－1αmRNA和蛋白表达水平增加，但 HIF－1α mRNA的表达峰值出现在2h，随后表达量逐渐减低，而蛋白质表达峰值出现在4h，二者之间存在表达时间点的差异。本研究结果发现：在到达海拔4400m高原48h后，正常人外周血单个核细胞中HIF－1αmRNA和蛋白表达水平无相关性，是否与表达时间点的不同有关，有待进一步探讨。

尽管HIF是一个细胞对于低氧环境反应调控的核心因子，但对于低氧环境的改变而表现出的敏感反应还有其他多种转录因子参加，并起着直接或间接的调控作用［13］。研究［4］发现：在缺氧条件下多种细胞类型中NF－κB信号通路被激活。本研究结果显示：急进海拔4400m高原48h之后，正常人外周血单个核细胞中RelA（p65）mRNA的表达水平明显高于急进高原前的表达水平。

Taylor等［14－15］报道：在低氧炎症发生中，HIF和 NF－κB之间存在cross－talk。在慢性炎症疾病中，组织的缺氧导致羟化酶的活性降低，诱导HIF依赖性适应基因表达的激活。炎症因子配体同时激活NF－κB通路和炎症因子、抗凋亡基因的表达通路。在cross－talk的两信号通路中存在着依赖 NF－κB的 HIF－1mRNA 表达上调和依赖 HIF－1的NF－κB的活性增加。NF－κB信号通路通过HIF－1羟化酶途进行调控。本研究结果显示：RelA与HIF－1α具有相关性，提示在其之间可能存在cross－talk现象。

本文作者通过对正常人外周血单个核细胞中RelA、HIF－1αmRNA和 HIF－1α蛋白表达水平与AMS相关性研究发现：HIF－1α蛋白表达水平与AMS发生率呈正相关关系，而RelA和 HIF－1α mRNA的表达水平与AMS发生率无相关性，是否是由于mRNA和蛋白质表达时间点的差异所引起，还有待探讨。本研究结果提示：HIF－1α蛋白表达水平可作为预测和干预AMS的监测指标。但本研究例数尚少，还待进一步探讨。

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