Notch信号分子在人NK细胞淋巴瘤细胞中的表达及其意义

胡彦伟，张明智，曹 玲，张旭东，刘倩倩，韩丽娟，胡腾鹏，杨 黎，文建国

（1.郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052；2.郑州大学第一附属医院 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052）

NK/T 细胞淋巴瘤（natural killer/T cell lymphoma）是非霍奇金淋巴瘤的一个亚型，发病率逐年增加，亚洲尤其是中国发病率远高于西方国家[1]。本病恶性程度较高，病程进展迅速，侵袭性强，由于对化疗疗效差、易复发及预后较差等特点，目前国际上尚无标准的治疗方案。因此近年来，寻找新的分子指标，以探讨NK/T细胞淋巴瘤的发病机制，为NK/T细胞淋巴瘤患者提供新的治疗方法成为研究热点。Notch信号分子广泛分布于造血干/祖细胞、胚胎干细胞、外周血淋巴细胞和血管内皮细胞等多种细胞表面，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡。研究[2]发现：在哺乳动物中有Notch 1～4共4种受体，其异常活化参与了多种实体瘤以及血液肿瘤，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等的发 病[2]。已 有 研 究[3－4]证 实：Notch 信 号 分子及下游靶基因在B淋巴瘤细胞Raji、T淋巴瘤细胞Jurkat和B/T细胞淋巴瘤组织中有异常高表达，

但在人NK细胞肿瘤中的表达情况国内外未见相关报道。本实验首次通过荧光定量PCR法检测人

NK细胞肿瘤细胞SNK-6、YTS中Notch信号的表达情况，以探讨Notch信号通路分子在肿瘤发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI1640培养基购自Solarbio生物医药公司；总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司产品，反转录试剂盒购自Fermentas生物有限公司，SYBR Green 1荧光实时定量PCR（FQ-PCR）试剂盒购自CWBIO生物有限公司。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养 选择人T、B、NK/T淋巴瘤细胞（人NK/T细胞淋巴瘤细胞SNK-6，人NK细胞淋巴瘤细胞YTS，人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat，人Burkitt’s淋巴瘤细胞Raji），将细胞置于37℃、50g·L－1CO2饱和湿度培养箱中，Raji、YTS、Jurkat细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液培养，SNK-6细胞用含100g·L－1人AB血清、1 000U·mL－1白介素2（欣吉尔）的RPMI 1640培养基培养。

1.3 RNA提取及cDNA合成 应用总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）按常规方法提取RNA，然后反转录酶试剂盒（Fermentas公司）合成cDNA均按常规方法进行。

1.4 引物设计 根据基因序列设计引物。Notch 1引 物 序 列： 上 游 5′-GTACCGAGGATGTGGACGAG-3′， 下 游 5′-ACACACACGCAGTTGTAGCC-3′，扩增目的片段长度为97bp；Notch 2引 物 序 列： 上 游 5′-GAAGGGAGCACCTGTGAGAG-3′ ， 下 游 5′-GCGGCAGTTGTAAGTGTTGA-3′，扩增目的片段长度为99bp；Notch 3引物序列：上游5′-GTCGTGGCTACACTGGACCT-3′，下 游 5′-AATGTCCACCTCGCAATAGG-3′，扩增目的片段长度为152bp；Notch 4引物序列：上游5′-GGGAAAAAGGCAATAGGC-3′，下游5′-GGAGGGAGAAGCCAAGTC-3′，扩增目的片段长度为168bp；Hes1引物序列：上游5′-AACACGACACCGGATAAACC-3′， 下 游 5′-CCGCGAGCTATCTTTCTTCA-3′，扩 增 目 的 片段长度为 151bp；β-actin引物序列：上游 5′－GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下 游 5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′，扩增目的片段长度为265bp。

1.5 FQ-PCR 利用 FQ-PCR 法检测各细胞系的Notch信号分子及下游靶基因表达情况，并将β-actin基因作为内参，应用SYBR Green Master Mix试剂盒，反应体积为25μL，包括2×SYBR Green Master Mix 38μL，cDNA 3μL，上游、下游引物各1.5μL，ddH2O 32μL，每组设3个复孔并重复3次。反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，64℃退火30s，循环40次。反应在ABI Fast 7500荧光定量PCR仪中进行。采用2－ΔΔCt法[5]计算基因表达水平。

1.6 PCR产物分析 将所扩增的PCR产物熔解曲线分析，同时将SNK-6产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以确定产物是否为所扩增的目的片段。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，所有数据均进行正态性检验，Notch信号分子在不同细胞中表达量以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 细胞总RNA的提取 应用总RNA提取试剂盒提取上述细胞中的总RNA。用紫外分光光度计测量总RNA的纯度及浓度，细胞中提取总RNA的 A260/A280值均为1.8～2.0。

2.2 实时定量 PCR 结果 Notch 1，3，4在YTS、SNK-6细胞中表达量均不同程度高于Raji和Jurkat细胞（P＜0.01），Notch 2在 YTS和SNK-6细胞中的表达量高于Jurkat细胞（P＜0.01），但是与Raji细胞比较差异无统计学意义（P＞0.05）。Notch下游靶基因Hes1在YTS细胞中的表达量高于Raji和Jurkat细胞（P＜0.05，P＜0.01），而在SNK-6细胞中的表达量均低于Raji和Jurkat细胞（P＜0.01）。见表1。

Notch信号分子的各个基因型的熔解曲线的熔解温度均一，峰的形状也较锐利，显示扩增的为特异序列（图1）。进一步经1.5%琼脂糖凝胶电泳，显示其片段大小正确（图2）。

表1 不同淋巴瘤细胞中的Notch信号分子的表达量Tab.1 Expressions of Notch signal molecules in different lymphoma cells （±s）

表1 不同淋巴瘤细胞中的Notch信号分子的表达量Tab.1 Expressions of Notch signal molecules in different lymphoma cells （±s）

＊ P＜0.01compared with Jurkat cells；△P＜0.05compared with Raji cells.

Cell Notch 1 Notch 2 Notch 3 Notch 4 Hes1 Jurkat 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 Raji 4.76±0.12＊ 5.22±0.12＊ 0.15±0.06＊ 50.95±0.68＊ 1.06±0.15 SNK-6 7.81±0.22＊△ 3.92±0.11＊ 15.29±0.66＊△ 141.34±1.02＊△ 0.12±0.02＊△YTS 10.20±0.29＊△ 5.78±0.68＊ 29.04±1.11＊△ 484.00±28.83＊△ 1.26±0.06＊△

图1 Notch信号分子的Real-time PCR扩增曲线（A）和溶解曲线（B）Fig.1 Curves of Real-time PCR amplification（A）and dissolution（B）of Notch signal molecules

图2 SNK-6细胞中Notch信号分子的PCR产物Fig.2 PCR products of Notch signal molecules in SNK-6 cells

3 讨 论

Notch与肿瘤的关系最早在T细胞白血病中被发现，是由于点突变或者染色体易位t（7；9）（q34：q34.3）引起 Notch 1信号的持续活化[6]。Notch信号通路是由Notch受体、Notch配体、CSL转录因子（DNA结合蛋白）和下游靶分子（Hes、Hey）4部分组成，通过受体与配体的相互作用，激活下游靶基因，调控细胞的增殖与分化。目前，人们对Notch分子的研究多见于对白血病的研究，对淋巴瘤方面的研究正逐渐增多，但是对NK细胞肿瘤的研究国内外未见报道。本研究首次通过FQ-PCR方法检测Notch信号在人NK细胞肿瘤细胞株中表达，并通过与其在Raji、Jurkat（已报道高表达 Notch信号分子[3－4]）中表达的比较，探讨NK细胞肿瘤的发病机制，并为进一步治疗提供初步依据。

Notch 1信号通路在T淋巴细胞肿瘤中的研究较多，在50% 左右的急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）病例中发现Notch 1基因点突变、插入和缺失等而引起其异常活化[7]。本研究结果显示：Notch 1在NK细胞肿瘤细胞（SNK-6、YTS）中的表达量明显高于Raji和Jurkat细胞，这可能为临床研究提供了初步的依据。目前已报道在多种B细胞肿瘤中存在Notch 2的异常表达，且其相关机制的探讨[8－9]也在进行中。本研究结果显示：在NK细胞肿瘤中Notch 2的表达量与其在B细胞中的表达量比较差异无统计学意义，NK细胞肿瘤与B细胞肿瘤可能存在相同的发病机制，这也为NK细胞肿瘤的研究提供了一种方向。有研究[10－12]发现：抑制Notch 3，4基因可明显的加强T、B细胞淋巴瘤细胞的凋亡。本研究结果显示：NK细胞肿瘤细胞中Notch 3，4的表达量明显高于B、T细胞淋巴瘤细胞，而抑制其表达将成为研究NK细胞肿瘤的下一个具体方向。

NK细胞淋巴瘤细胞（YTS）和鼻NK/T细胞淋巴瘤细胞（SNK-6）细胞均起源于成熟的NK细胞肿瘤，而鼻NK/T细胞淋巴瘤既表达NK细胞相关性抗原，也表达一些细胞毒性T细胞相关性抗原，在SNK-6细胞中，Notch 1，3，4异常高表达均不同程度低于YTS细胞，这种差异表达可能是NK肿瘤细胞发展为不同表型的NK/T细胞淋巴瘤或是发展为NK细胞淋巴瘤的一个重要因素，有待进一步研究。而YTS细胞中Notch下游靶基因Hes1的表达量高于Raji、Jurkat细胞，但是SNK-6细胞中 Hes1的表达量明显低于Raji和Jurkat细胞，这可能与NK/T细胞淋巴瘤发生发展过程中通过不同的下游靶基因而发挥作用，如Hey家族分子而发挥抗增殖作用有关。Notch信号分子在人NK/T淋巴瘤细胞株及NK细胞淋巴瘤细胞株中异常表达提示：Notch信号分子可能在人NK细胞肿瘤发病机制中存在着重要的作用，相关机制还需进一步研究。

综上所述，本研究初步分析了Notch信号分子在人NK细胞肿瘤细胞株中的表达特点，发现其异常高表达，提示Notch信号分子可能参与了NK细胞肿瘤的发生发展过程，本研究结果为进一步探讨NK细胞肿瘤的发病机制及治疗提供了初步依据。

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