中国海南黎族人群LMP2／LMP7基因多态性与肺结核病的关联性

王丹妹，何 佟，吉丽敏，林 峰，林 容，林堂昌，莫燕娜

（1.海南医学院机能室，海南 海口 571101；2.海南省疾病预防控制中心结核所，海南 海口 570203；3.海南省三亚市人民医院呼吸内科，海南 三亚 572000）

肺结核病（PTB）是当今世界单一致病菌引起死亡率最高的疾病，是由结核杆菌感染，在宿主自身和环境等因素之间复杂的相互作用引起的一种疾病。结核杆菌感染后是否发病，表现出明显的个体差异，仅有10%的感染者表现出临床症状，而大部分的感染者靠自身的免疫力抵抗结核杆菌的感染或成为健康带菌者。有研究［1－3］表明：遗传因素在决定宿主个体对结核杆菌的易感上起着重要作用。目前已证实：结核病的易感性与人类自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1（NRAMP1）基因、维生素D受体（VDR）基因、人类白细胞抗原（HLA）－DR基因和TAP基因等有关。相对低分子质量蛋白酶体（low molecular weight proteasome，LMP）是1982年Monaco在分析鼠MHC－Ⅱ类分子的免疫沉淀复合物过程中得到的一种产物，参与细胞浆中内源性抗原的降解，水解抗原成为适合的肽段，并经转运后能够与MHC－Ⅰ类分子连接，且表达在细胞表面，然后被CD8＋T淋巴细胞所识别，LMP对于机体的内源性与外源性抗原的免疫应答有着非常重要的作用。有研究［4－7］报道：LMP基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与一系列免疫相关性疾病的发生有着十分密切的关联性。但目前未见LMP基因的多态性与结核病相关性的研究报道。为研究LMP基因的多态性与黎族人肺结核病的关系，本文作者选取LMP2、LMP7基因中具有氨基酸改变的2个多态位点（Codon60／Codon145），对海南黎族正常人群和结核病患者进行了SNP位点的检测，并对其进行了易感性的关联分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象 病例组：2006—2008年在海南黎族人居住较多的地区本文作者共采集黎族肺结核患者205例，其中白沙县37例，五指山市32例，昌江县75例，三亚市20例，东方市41例，均为经当地结核防治所和海南省结核防治所根据临床表现和胸部X线、痰涂片阳性确诊的肺结核患者。按国家统一标准进行诊断，即痰菌阳性同时胸部X线片有肺结核特征病灶；或痰菌阴性，但胸部X线片示活动性肺结核征像，PPD试验强阳性并具有明显肺结核临床体征者；同时排除肺癌、肺炎、尘肺、糖尿病和肿瘤等免疫功能低下者，未使用肾上腺皮质激素及其他免疫抑制剂，无HIV感染。其中男性138例，女性67例，年龄18～79岁，平均年龄（41.90±16.77）岁，每例患者由当地结核防治所协助采集静脉血。

对照组：在海南黎族人居住较多的地区随机选取与病例组无血缘关系的健康人群作为对照组，经详细询问家族史确定为黎族，经病史询问以及常规体格检查确定健康状况良好，无长期用药史，均经胸部X线检查，排除有肺结核病史。对照组研究对象共217例，其中男性105例，女性112例，年龄18～84岁，平均年龄（37.25±13.97）岁，标本采集与病例组相同。在标本采集的同时收集每个研究对象详细的人口学资料、吸烟史和饮酒史等资料。所有研究对象均由专业人员进行现场问卷调查。

1.2 提取基因组DNA 抽取每例研究对象静脉血2mL，用全血基因组快速提取试剂盒（天为时代公司）提取外周血细胞DNA。

1.3 多态性位点的选择及引物设计 LMP2／LMP7基因位于染色体6p21.3区域，根据文献选择上述2个基因各自位于第二外显子的2个SNP位点［1，7］：LMP2－Codon60处多态位点的存在使得所编码的精氨酸（Arg）置换为半胱氨酸（Cys）；LMP7－Codon145处位点则为谷氨酰胺（Gln）置换为赖氨酸（Lys），在 GenBank（GenBank accession number：AF027865）中检索到LMP2／LMP7基因的全长序列，利用Primer 5.0软件，设计针对LMP2／LMP7中每个位点的PCR扩增引物，引物由上海申友生物技术有限公司合成，测序引物均分别采用各自上游引物。见表1。

1.4 聚合酶链反应（PCR） PCR体系总体积为50μL：其中上下游引物各1μL（20mol·L－1），DNA模板4μL（500ng），Taq DNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性40s，退火40s，温度分别为56.5℃（LMP2－Codon60）、57.0℃（LMP7－Codon145），72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

1.5 基因多态性分析 采用RFLP法进行基因多态性分析。PCR产物经纯化后，取PCR产物10μL（DNA约1μg）、加限制性内切酶HhaⅠ、BsmⅠ（BIOLABS公司）对LMP2－Codon60、LMP7－Codon145位点进行酶切。取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带数判断每一个体LMP2／LMP7的基因型，由北京天根生化公司对不同基因型进行结果测序验证。见表2。

表1 LMP基因多态性位点与引物序列Tab.1 Polymorphism sites of LMP and primer sequences of LMP gene

表2 LMP基因限制性内切酶酶切片段长度、识别位点、所需温度和时间Tab.2 Restriction fragment length，recognition site，required temperature and time of LMP gene

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。采用卡方检验验证病例组与对照组之间基因型频数是否符合Hardy－Weinberg平衡定律；多态性与结核杆菌感染风险之间的相关性以比值比（OR值）及其95%可信区间（95%CI）表示，OR值及其95%CI以非条件Logistic回归模型分析，均经年龄、性别等混杂因素校正。

2 结 果

2.1 PCR与酶切结果 采用PCR－RFLP法对病例组和对照组人群进行LMP2／LMP7扩增后产物进行检测。扩增产物经HhaⅠ酶切后，LMP2可观察到3种不同的基因型：330bp长度的多态纯合型（Cys／Cys）；79和251bp 2条区带的野生纯合型（Arg／Arg）；79、251和330bp 3条区带的杂合型（Arg／Cys）。LMP7也观察到3种不同的基因型：351bp长度的多态纯合型（Lys／Lys）；146和205bp 2条区带的野生纯合型（Gln／Gln）；146、205和351bp 3条区带的杂合型（Gln／Lys）。

2.2 LMP2／LMP7测序结果 通过对病例组患者与对照组健康人群的2个基因多态性位点分别进行双侧测序法直接测序，结果显示：LMP2／LMP72个位点在进行检测的样本中，均存在多态性。LMP2－Codon60处位点存在由C变为T的多态性，其多态性致使编码的LMP2蛋白第60位密码子由CGC置换成TGC，即导致氨基酸由原来的精氨酸（R）改变为半胱氨酸（C）；LMP7－Codon145处位点存在C→A的多态性，该多态性致使编码的LMP7蛋白的第145位密码子由原来的CAG置换为AAG，即相应地导致氨基酸由原来的谷氨酰胺（Q）变为赖氨酸（K）。

2.3 Hardy－Weinberg平衡检验 对病例组和对照组人群中2个多态位点进行酶切检测，读取各3种基因型数据并进行统计，经检验其等位基因频数的分布符合Hardy－Weinberg平衡定律（P＞0.05）。

2.4 病例组和对照组LMP／LMP7多态性位点基因型频数 LMP2－Codon60位点多态性：病例组与对照组比较，野生纯合型Arg／Arg（R／R）、杂合型 Arg1／Cys（R／C）和多态性纯合型Cys／Cys（C／C）之间基因型频数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。LMP7－Codon145位点多态性：病例组的杂合型频数、多态性纯合型分布明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。野生纯合型Gln／Gln的基因型频数与纯合型Lys／Lys比较，OR＝3.77，95%CI［1.60，8.89］（P＜0.05）； 与杂合型Gln／Lys比较，OR＝2.97，95%CI［1.80，4.90］（P＜0.01）。见表3。2.5 海南黎族结核病与LMP2基因多态性各基因型的风险关联分析 多因素Logistic回归分析发现：病例组与对照组多态性纯合基因型（Cys／Cys）和杂合基因型（Arg／Cy1），分别与野生纯合基因型（Arg／Arg）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；结果显示：在海南结核病高发区，黎族人群中的LMP2－Coden60位点的多态性与结核病风险可能不存在关联性。

表32 组LMP2／LMP7多态性位点基因型频数Tab.3 Genotypic frequencies of LMP／TAP SNP sites in two groups ［n（η／%）］

3 讨 论

结核病是当今世界由单一致病菌引起死亡率最高的疾病之一，全球约有1／3人口感染结核分枝杆菌，每年约有900万新发的结核病患者，300万人死于结核病。中国是全球22个结核病高负担国家之一，世界卫生组织评估显示：目前中国结核病年发病人数约为130万，占全球发病人数的14%，位居全球第2位。80%结核患者主要分布在老少边穷的地区。黎族是唯一分布在海南省的少数民族，本课题组成员的前期研究［8］结果显示：海南黎族人群痰液涂片中，结核杆菌阳性检出率达到13.1%，高于同期各市县汉族人群9.9%的平均水平。除了经济和医疗水平落后等因素影响外，宿主个体遗传因素可能在结核杆菌的易感上也有重要作用。

国内外对 LMP2基因多态性位点的研究［1，7，9］大多定位于这一基因的第60位编码氨基酸处。本研究对所有的结核病患者样本和健康对照人群的总样本检测过程中发现：LMP2－Codon60处位点由CGC中的碱基C处发现多态性位点的存在，即由碱基C置换为碱基T（CGC→TGC），此碱基的多态性的变化致使精氨酸成为半胱氨酸，因而这一碱基的改变同时也造成酶切位点的丧失。本研究结果与戴悦等［6－7］的研究报道相符。

LMP7－Codon145位点由CAG中的碱基C置换为A，其多态性使编码氨基酸谷氨酰胺（Q）变为赖氨酸（K）（Gln→Lys），即相应地由不带电荷的谷氨酰胺转为带正电荷的赖氨酸。本研究结果显示：海南黎族人群LMP7基因的多态性位点与上述一致；多态性杂合基因型与多态性纯合基因型在病例组中的频数分布明显高于对照组，差异有统计学意义。在本研究病例组与对照组的关联分析中：野生型纯合Gln／Gln与多态性纯合Lys／Lys之间基因型频数的比较，OR＝3.77，95%CI［1.60，8.89］，结果显示：LMP7－Codon145位点碱基编码Lys组成的等位基因型Lys／Lys能够增加结核病3.77倍的罹患风险；野生型纯合Gln／Gln与杂合型Gln／Lys之间基因型频数分布比较，OR＝2.97，95%CI［1.80，4.90］，显示杂合型Gln／Lys能够增加结核病2.97倍罹患风险。本研究结果表明：LMP7基因多态性是海南黎族人群肺结核的易感基因。其影响结核的易感性机制，可能是由于LMP水解内源性抗原所得到的肽段羧基端多是碱性及疏水性氨基酸残基［8］，其多态性可导致水解酶在作用过程中肽段性质或者长度的改变，这一系列的变化，可能影响了机体对于结核病发生的免疫抵抗［7，9－10］。

LMP基因的多态性有着种族、民族、个体差异、不同人群的疾病易感性和药物治疗的敏感性以及对环境反应的分子基础、地域分布频率差异性，也与众多的免疫性疾病有着风险关联［13］。本研究在相对封闭并且环境与遗传背景相对一致的海南黎族人群中，对LMP2和LMP7基因多态性与结核病风险进行了关联性研究，结果提示：LMP7基因多态性与海南黎族结核病有较强的易感关联，本研究结果为海南黎族结核患者早期风险性评估、早期诊断和优选干预措施提供了更多依据。相对于遗传易感因素来说，每个多态性位点的存在并不只是起着一个独立的作用，其相互之间也存在着一定的内在关联，所以LMP基因在结核病发生发展中的作用还有待进一步的研究。

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