香菇单孢杂交及杂合子鉴定的研究

陈世通，白建波，李梦杰，李荣春

(云南农业大学食用菌研究所，云南 昆明 650201)

单孢杂交是香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler新品种选育最常用的育种方法[1]。目前我国香菇生产上广泛使用的品种大多来自国外，缺乏自主知识产权的品种，而且由于栽培年限普遍较长，退化现象严重，因此香菇新品种选育成为人们十分关注的课题。笔者以“大山18”和野生香菇“11－1”作为亲本进行单孢杂交育种，以期选育出优良新品种。

ISSR是一种基于基因组简单重复序列的DNA标记技术[2]。本研究用ISSR标记对香菇单孢杂交后代进行了鉴定，探讨了在杂合子鉴定中应用ISSR标记的可行性，现将试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

亲本为香菇栽培品种“大山18”、云南野生香菇“11－1”，均由云南大山合公司提供。

1.2 培养基

单孢分离和配对杂交培养基：PDA培养基；菌丝液体培养基：液体PDA培养基。

1.3 亲本选择

“大山18”是云南大山合公司广泛栽培品种，盖大肉厚，较耐高温，产量高。最大不足是菌柄过长，菌丝抗污染能力不强。“11－1”是采自云南龙陵的野生香菇菌株，经驯化栽培表明，该菌株的菌柄短，并且菌丝抗污染能力较强。以优势性状互补的“大山18”和“11－1”作为亲本，由于在生态类型上有较大的遗传差异，后代出现杂种优势的机会更大。

1.4 单孢分离

[3]、 [4]。

1.5 配对杂交

将单核菌株随机配对杂交，培养至菌丝交接在一起时，挑取融合菌丝镜检，将有锁状联合者扩大培养。

1.6 拮抗试验

在平板内用三点接种法接种亲本“大山18”、“11-1”和杂交菌株，观察各菌株之间的拮抗反应。

1.7 杂交菌株的ISSR鉴定

1.7.1 DNA的提取

将杂交菌株和亲本菌株分别接种于液体培养基内，15 d后过滤收集菌丝并提取DNA。

1.7.2 ISSR引物筛选

本试验参照参考文献[5]选用了12个引物，对两亲本DNA进行PCR扩增。供试的ISSR引物及其序列见表1。

表1 供试的ISSR引物及其序列

PCR反应体系 （20μL）见表2。

表2 PCR反应体系

PCR反应程序见表3。

表3 PCR反应程序

将扩增产物进行电泳，之后在紫外凝胶成像系统上观察，并从中筛选出条带清晰且含有2个亲本特异性条带的引物。

1.7.3 杂交菌株的鉴定

利用筛选出的引物对杂交菌株和亲本单核菌株进行ISSR-PCR扩增。PCR的反应体系和循环参数见表2和表3。扩增反应结束后进行电泳，之后在紫外凝胶成像系统上拍照并记录扩增图谱。

2 结果与分析

2.1 配对杂交结果

杂交成功的菌落交界处会出现白色绒毛状的异样菌丝，如图1单孢杂交配对反应中箭头1所示。本试验共获得84个杂交菌株，分别编号DO-i(i=1、2、3……84)。

2.2 拮抗试验

将84个杂交菌株与两亲本在平板上做拮抗试验，有45个杂交菌株与两亲本出现很明显的拮抗线，说明这45个菌株与两亲本有了质的不同，是杂交所得的新菌株（如图2箭头1和2所示）。而其它39个菌株与亲本“大山18”的菌丝可以相互交叉，无拮抗反应（如图2箭头3所示）。

2.3 ISSR分子鉴定

DNA分子标记对杂交菌株的鉴定是从遗传物质的不同来源进行鉴定的。杂交菌株应同时拥有两亲本的特异条带，杂交种与双亲的条带在凝胶中对应于同一水平线上[6]。

引物筛选结果表明，ISSR6引物能扩增出两亲本的2条特异条带（图4箭头1所指条带为“大山18”特有，箭头2所指为“11-1”特有），所以选择此引物对杂交菌株进行鉴定。其它11个引物都扩增不出两亲本的特异条带。

ISSR分析表明有39个菌株只有亲本“大山18”的特异条带（如图3中的DO5所示），结合拮抗试验可以断定，这39个菌株并不是两亲本的杂合子。剩下的45个菌株有两亲本的特异条带，从分子层面证明这45个菌株是两亲本真正的杂合子。

3 讨论

笔者成功用ISSR标记从大量杂交后代中鉴别出真杂合子，这在国内外尚无相关报道，具有一定的原创性。运用ISSR技术能在菌丝体阶段鉴别出真杂合子，相比鉴定周期长的形态学标记，加速了育种进程。将ISSR标记开发成一种稳定可靠的分子标记，对香菇遗传育种研究具有重大意义。

在后继的研究中，将对鉴定出的杂交菌株进行栽培出菇，摸清杂交菌株的温型和菌龄，对提高它们的综合性状有重要意义。

[参考文献]

[1]王卓仁，刘启燕，肖扬，等.香菇单孢杂交子代群体灰色关联度和ISSR分析[J].菌物学报，2010，29(2)：267-272.

[2]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20 (2)：176-183.

[3]刘宇，王守现，耿小丽，等.杏鲍菇14号杂交菌株选育研究[J].中国食用菌，2011，30 (6)：15-17.

[4]李冠喜，华国栋，王多明，等.采用同核体单孢杂交育种技术选育双孢蘑菇[J].食用菌学报，2011，18 (3)：17-21.

[5]刘勇.四川攀西野生香菇遗传多样性与生理特性分析[D].四川农业大学硕士学位论文，2008.

[6]傅俊生，朱坚，谢宝贵，等.草菇杂交菌株2628的鉴定与品比试验[J].中国农学通报，2010，26 (14)：48-53.