脂肪添加量和冻藏时间对冷冻水饺肉馅肌原纤维蛋白氧化和凝胶特性的影响

黄 莉，孔保华*，夏秀芳，李 菁，赵钜阳，冯金凤，常 钊

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.日照职业技术学院食品工程学院，山东 日照 276826)

速冻水饺是深受人们喜爱的具有传统特色的方便食品，随着速冻产业的发展，生产冷链的健全，速冻水饺的生产量在逐年递增，但速冻水饺在贮藏过程中食用品质会下降，口感变得粗糙。国外一些学者研究认为蛋白质的凝胶性是影响食品形成最佳质构和风味的重要因素[1-2]。肌肉蛋白凝胶的流变性质现已被广泛研究，研究内容包括不同原料肌肉(牛肉、猪肉、鱼肉)[3]，加工条件(盐离子强度、pH值)、添加成分(磷酸盐、抗氧化剂)等[4-5]对蛋白凝胶黏度弹性的影响，进而阐述加工条件对产品组织结构的影响。对于经过斩拌和重新成型的肉制品，肌原纤维蛋白形成凝胶的能力对产品的质地和黏聚性起到关键作用[6]。在东方国家，尤其是日本，为了使肌原纤维蛋白凝胶形成能力最大化，通常将肌肉斩拌。蛋白的凝胶化有益于产品形成最终的组织结构和风味特性[1]。但是，肉制品在加工贮藏过程中，由于温度的波动、脂肪氧化、以及酶的作用，会使脂肪和蛋白质发生氧化。肌原纤维蛋白的氧化可以导致氨基酸侧链基团的损伤、肽键的断裂、蛋白质的交联、变性、形成新的活性基团—羰基，增加对蛋白水解酶的敏感性等，并对蛋白凝胶的结构产生影响[7]。Xia Xiufang等[8-9]研究猪背部最长肌经过不同的冷冻-解冻循环，发现随着循环次数的增加，肉中脂肪氧化和蛋白氧化程度加深，肌原纤维蛋白凝胶的保水性，凝胶性和乳化性均下降，凝胶的三维网状结构变得疏松，从而导致肉的食用品质下降。

水饺肉馅是由瘦肉、动物脂肪、植物油、水、食盐、香辛料等组成的一个非常复杂的不完全乳化体系，脂肪的添加有助于水饺形成鲜香多汁的口感，并且可以降低生产成本。在前期试验中，本实验组研究了不同脂肪添加量对速冻水饺在－18℃条件下贮藏0～180d的脂肪氧化程度及其品质的影响，表明随着脂肪添加量的增加和冻藏时间的延长，水饺肉馅的脂肪氧化增加，颜色变差，并且水饺的蒸煮损失增加，弹性、硬度、黏聚性、咀嚼性整体上呈下降趋势。本实验进一步研究不同脂肪添加量对速冻水饺在不同的贮藏时间内，肉馅中肌原纤维蛋白氧化和凝胶性的变化对水饺感官品质的影响，以进一步揭示速冻水饺在贮藏过程中品质变化的本质，并为速冻水饺的生产贮藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉肩颈肉、背部肥膘 南京雨润食品有限公司；金龙鱼大豆油 嘉里粮油(营口)有限公司；五香粉 王守义十三香调味品有限公司；葱姜 大润发超市；酱油 海天调味食品有限公司；食盐 中盐红波集团；面粉 海粮油工业有限公司。

实验所用其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1800紫外-可见光分光光度计 北京普希通用仪器有限公司；MAL1038384流变仪 英国马尔文仪器有限公司；Mini电泳仪 美国Bio-Rad公司；冷冻离心机 美国Beckman公司；HR2860型高速组织捣碎机 珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司；凝胶成像系统 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷冻水饺的制作

取屠宰后排酸24h的猪肉肩颈肉和背部肥膘，用保温箱加碎冰运至农大肉制品加工实验室。在冷库(4℃)中操作，剔除表面可见筋膜，切成小块，用绞肉机绞碎，筛孔直径4mmol/L。将肥肉、瘦肉、调味料、大豆油等辅料按表1比例添加，搅拌均匀，调制肉馅，称量肉馅(10.0±0.1)g，包成饺子，盛于托盘中，放在–25℃冰柜中冷冻过夜(至少20h)，取出后用保鲜袋分装，此时取部分样品用于测量0月的各指标。将分装好的水饺贮存于－18℃冰柜，待测其他各月的指标。

表 1 冷冻水饺肉馅的配方Table 1 Formulas of ground meat in frozen dumplings g

1.3.2 羰基含量的测定

肌原纤维蛋白提取：参考Park等[7]的方法，取出冻藏的水饺肉馅，放在4℃冰箱中解冻，待中心温度至0℃左右时，剥掉水饺面皮，称量肉馅并提取肌原纤维蛋白；羰基含量测定：参照Xia Xiufang等[9]的方法。

1.3.3 肌原纤维蛋白凝胶的流变学测定

肌原纤维蛋白凝胶黏弹性可以通过动力流变学试验测定，储能模量(storage modulus，G’)可以阐明蛋白质凝胶和蛋白质网状结构形成的机理。测试方法依据Xia Xiufang等[8]的方法并略作修改。将从水饺肉馅中提取的肌原纤维蛋白溶解在0.1mol/L NaCl溶液中配制成40mg/mL的溶液。在动态流变仪中使用直径60mmol/L的平行板来实现小振幅的剪切测试，平行板间的空隙选择1mmol/L、加热速率1℃/min、温度范围为30～85℃，并在85℃保持3min，振荡频率0.1Hz、应力振幅0.02。为防止试验过程中的水分蒸发，在夹具固定的保温环中加入蒸馏水并使用保温套罩住夹具和样品。

1.3.4 肌原纤维蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

将从不同脂肪含量的水饺肉馅中提取的肌原纤维蛋白用样品溶解液(pH6.8的Tris-HCl缓冲液、10% β-巯基乙醇溶液、20%甘油溶液)稀释成1mg/mL的溶液。混合物100℃水浴3min，备用。

参照Park等[7]和郭尧军[10]的SDS不连续电泳方法，浓缩胶质量浓度5g/100mL、分离胶质量浓度10g/100mL。获得的电泳胶片置于天能凝胶成像仪摄像，结合Tanon软件进行分析和处理。SDS-PAGE标准分子质量蛋白由中科院上海生物化学研究所提供。

1.3.5 水饺的感官评价

熟制的水饺的感官评价是由感官评价小组在感官评价室完成的。感官评价小组是由8位受过专业训练的人员组成并具有肉制品的感官评价经验。感官评价的指标包括水饺的质构、多汁性、酸败味和整体接受性。每个评价者每组评价两个饺子，在煮制后立即进行评价。评价指标采用10分制。对于质构，1=粗糙，10=光滑；对于多汁性，1=干燥，10=多汁；对于酸败，1=感觉不到，10=严重的刺激气味；对于整体接受性，1=低，10=高。样品评价的间歇，评价人员用温水漱口并处在正常灯光下，样品是随机发给每个评价人员的。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 冷冻水饺肉馅在冻藏期间的蛋白氧化

肌原纤维蛋白羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白质发生氧化后一个显著变化，羰基被广泛地用于测量蛋白质的氧化程度。从图1可知，贮藏0d的水饺肉馅中肌原纤维蛋白中羰基含量为1.52～1.93nmol/mg蛋白，这个结果与Morzel等[11]从新鲜的猪背部最长肌中提取的肌原纤维蛋白(1.70nmol/mg蛋白)的羰基含量非常接近。随着贮藏时间的延长和脂肪添加量的增加，羰基含量显著增加(P＜0.05)。冷冻水饺贮藏180d时，各组中羰基含量是贮藏0d时羰基含量的2倍左右，添加脂肪的各组中羰基含量显著高于未添加脂肪组(P＜0.05)。脂肪氧化产物会引发蛋白氧化产生更多的羰基[12-13]，随着脂肪添加量的增加，水饺肉馅中脂肪氧化产物增加，因此羰基的含量迅速增加。羰基含量的增加与肌肉中蛋白质功能性的下降相关，比如蒸煮损失的增加，凝胶性下降等。Liu Zelong等[14]表明猪肉背部最长肌肌肉在40mmol/L和50mmol/L H2O2条件下氧化2min，或者在20mmol/L H2O2氧化40min，蛋白质羰基显著增加，肉的持水力和肉的重量显著地下降。关于蛋白氧化降低肉的持水力，Huff-Lonergan等[15]认为，肌肉在动物死后僵直、成熟的过程中会增加肌原纤维蛋白氧化，降低蛋白的功能性。因为μ-钙蛋白酶(Calpain)和m-钙蛋白酶的活性位点包含组氨酸和含有巯基的半胱氨酸的残基，他们易因氧化而钝化。氧化可以导致肌肉中钙蛋白酶失活或者被修饰，进而影响钙蛋白酶的活性和蛋白水解，并影响肉品的品质如嫩度和持水性。

图 1 脂肪添加量对冷冻水饺肉馅冻藏过程中羰基含量的影响Fig.1 Effect of fat content on carbonyl content of dumpling fillers during frozen storage

2.2 冷冻水饺肉馅在冻藏期间肌原纤维蛋白凝胶性的变化

肌原纤维蛋白形成凝胶的能力是肉制品加工中的一个重要功能特性，与其他功能性共同作用赋予了肉制品的黏弹性、多汁性、质构等性质，加工条件如pH值、离子强度、肌肉的类型等会影响肌原纤维蛋白的持水性和黏弹性[3]。肌原纤维蛋白凝胶流变学变化如图2所示。储能模量的值(G′)通常被用来衡量物质(材料)结构特性的变化，显示样品主要的弹性行为的热流变性[16]。贮藏0d的未添加脂肪的水饺肉馅中提取的肌原纤维蛋白的凝胶流变曲线变化表明，加热到35℃，G′稍有增加，这时凝胶网络结构开始形成。在36～57℃ G′明显增加，这说明这个蛋白凝胶体系呈现出更具有弹性的结构。肌球蛋白的尾部与尾部通过疏水键相互作用促进了G′和弹性的增加[17]。这表明肌原纤维蛋白中起到热凝胶作用的蛋白质主要是肌球蛋白，肌球蛋白的轻链在蛋白质结构部分伸展时从重链中分离出来，形成三维结构。继续加热，G′迅速降低至69℃又迅速增加，表明形成了不可逆的凝胶网络结构。随着贮藏时间的延长，肌原纤维蛋白的储能模量值均下降，峰值对应的温度降低。对于未添加脂肪的样品，冻藏时间分别为0、30、60、90、180d，G′对应的最大值分别是5727(56.9℃)、4943.8(55.0℃)、3001.5(55.7℃)、3707.8(54℃)、2428.3Pa(53℃)，可以看出G′的变化趋势是随着冻藏时间的延长，G′的最大值逐渐减小，G′最大值对应的温度不断减小，这说明在冻藏过程中肌原纤维蛋白的变性程度不断加深，G′数值的降低可能是由于肌动蛋白的复合物的分离和肌球蛋白尾部的变性引起的。其他添加不同量的脂肪的组中G′的变化趋势与未添加脂肪的组一致。从贮藏30、90、180d的G′曲线可以看出，随着脂肪添加量的增加，G′的数值逐渐下降，脂肪添加量为40%、贮藏180d的水饺样品提取的肌原纤维蛋白的G′曲线已经变成平滑曲线，这说明随着温度的升高，肌球蛋白的轻链和重链经历了构型上的变化，片段化，增加了流动性[1,17]，肌原纤维蛋白已经完全变性。

图 2 脂肪添加量对冷冻水饺肉馅冻藏过程中肌原纤维蛋白凝胶特性的影响Fig.2 Effect of fat content on gelation of porcine myofibrillar protein in dumpling fillers during frozen storage

2.3 冷冻水饺肉馅在冻藏期间肌原纤维聚集情况的变化

图 3 脂肪添加量对冷冻水饺肉馅冻藏过程中肌原纤维蛋白聚集情况的影响Fig.3 Effect of fat content on porcine myofibrillar protein aggregation of dumpling fillers during frozen storage

图3为从不同贮藏时间的水饺肉馅中提取的肌原纤维蛋白在10%的电泳凝胶中的蛋白质条带。图4为利用Tanon软件对肌球蛋白重链和肌动蛋白条带的变化进行定量分析。从图3、4可以看出，对于相同脂肪添加量的水饺肉馅，随着贮藏时间的延长，肌原纤维蛋白中的肌球蛋白和肌动蛋白的含量整体上是呈下降的趋势的，这说明在贮藏过程中的发生的氧化反应不完全是二硫键的交联作用，它可能包括羰基和氨基集团之间西弗碱(schiff bases)的形成[14]。随着脂肪添加量的增加，肌球蛋白和肌动蛋白的含量也呈下降趋势，这说明肌球蛋白重链和肌动蛋白发生了不同程度的聚合或降解。对于相同脂肪添加量的样品，肌球蛋白的轻链1随着贮藏时间的延长，条带变浅；肌球蛋白轻链2变化更明显些，贮藏180d时，已经没有条带了，这说明肌球蛋白的轻链2已经完全被氧化降解或生成了其他物质。氧化的肌原纤维蛋白产生羰基，羰基可以与未氧化的氨基酸的游离氨基形成氨基化合物。如果在不同的蛋白质之间发生这种反应，它可以导致蛋白质的聚合和聚集。同样，巯基氧化可导致二硫键产生分子内交联[11]。

图 4 脂肪添加量对肌原纤维蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白含量在冻藏过程中的变化影响Fig.4 Effect of fat content on percent content of myosin and actin in porcine myofibrillar protein in dumplings fillers during frozen storage

2.4 冷冻水饺肉馅在冻藏期间感官品质的变化

表 2 冷冻水饺的感官评价表Table 2 Sensory evaluations of dumplings

由表2可知，随着脂肪添加量的增加，水饺的质地的光滑性和多汁性显著增加(P＜0.05)，但脂肪添加量40% 组中质构和多汁性得分较低，这可能是因为该组中因含有较高的脂肪含量而蛋白含量降低，使得蛋白对脂肪和水的保持能力下降，在熟制过程中脂肪和水分流失较多，这一点和前期的研究中蒸煮损失随着脂肪添加量的增加而增加是一致的。对于酸败味来说，脂肪在冻藏过程中会发生脂肪氧化，而脂肪氧化的终产物(醛、酮类)会产生酸败味，较高的脂肪添加量产生较多的醛和酮类物质，所以脂肪含量高的样品中酸败味会更明显。此外，冻藏时间也显著地影响水饺的感官品质。随着冻藏时间延长，尤其是在90d后，水饺的质地明显地粗糙(P＜0.05)，多汁性显著降低(P＜0.05)，酸败味显著增加(P＜0.05)，整体接受性显著变差(P＜0.05)。质地变得粗糙，这与蛋白的凝胶性在90d后显著下降是一致的。在肉制品中，碎肉中的肌原纤维蛋白形成凝胶对制品的黏聚性和质构特征起决定作用。随着冻藏时间的延长，肌原纤维蛋白的凝胶性变差，导致水饺的质地变得粗糙。水饺的多汁性降低可能是因为在冻藏过程中冰晶的增加和蛋白发生氧化变性而使蛋白结合的水分减少[18]，蛋白和醛类相互作用导致蛋白变性和聚集，使肉制品的质地变得坚硬[19]。

3 结 论

随着贮藏时间延长和脂肪添加量的增加，水饺肉馅中肌原纤维蛋白的羰基含量增加，储能模量G′的峰值降低，对应的变性温度降低，肌球蛋白和肌动蛋白的百分含量下降，表明肌原纤维蛋白的氧化加重，凝胶的黏弹性下降，肌原纤维蛋白的变性程度增加。水饺的质地变得粗糙，多汁性和总体接受性下降。所以冷冻水饺的肉馅在冻藏过程中品质降低的主要原因是肉馅中的肌原纤维蛋白因氧化变性而导致肌球蛋白和肌动蛋白发生不同程度的聚合或降解，使其形成凝胶的能力和持水能力下降。建议冷冻水饺在加工冻藏过程中应考虑生产配方，选择合适比例的背膘以兼顾生产成本和水饺的贮藏质量，尽量减少肌原纤维蛋白的氧化变性程度，以保持水饺鲜嫩多汁的口感。

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