养殖尼罗罗非鱼鲜度特征及动力学模型构建

郭全友，王锡昌*，姜朝军，张书萍，江 航，赵克俭

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.上海理工大学理学院，上海 200090)

鱼类被认为是人们膳食中极有价值的蛋白质来源，因其肉味鲜美，肉质细嫩而受到人们的喜爱。罗非鱼作为一种高消费量和高商业利润的世界性养殖鱼类，具有食性杂、耐低氧、不耐低高温，繁殖强等特点，并且肉质厚、骨刺少，富含多种不饱和脂肪酸，被公认为健康食品，称其为“21 世纪之鱼”[1]。中国罗非鱼产量约占世界产量的55%，绝大部分以鲜活流通为主，但运输难、成本高，以保持低温环境为核心要求的供应链系统得以应用。近年来研究者对罗非鱼低温贮藏过程质量变化和细菌种群等进行了研究，构建了特定腐败菌(specific spoilage organisms，SSO)生长动力学模型和货架期预测模型[2-6]。供应链中始终保持低温并非易事，实际中往往脱离冷却链甚至滥用温度，夏季时鱼体温度可能达到室温。低温和室温下鱼类SSO差别甚大，一旦超出设定的低温范围，货架期预测模型将无法使用。因此必须要选择和测定有效的质量指标，试验设计要覆盖所有可能范围的温度条件，选择合适的动力学模型，进而开发新的货架期预测模型，并经过变温和恒温等实际流通条件的验证。

每种水产品在给定条件下都有自身特有的优势菌群、腐败范围和腐败特征等，特别对新产品或改进型产品的腐败菌和腐败范围往往还未知晓，进行相关研究可为理解腐败现象和靶向抑制提供基础[7-9]。温度对货架期的影响常用腐败速率(rate of spoilage，RS)，即货架期的倒数(d-1)进行测定[10-12]。研究发现虽然新鲜水产品间货架期差异显著，但温度对相对腐败速率(relative rate of spoilage，RRS)的影响具有相似性[6]，RRS模型是依据不同温度下的货架期来开发的，其优点是能在较大的温度范围内得到验证，仅仅需要提供产品所经历的温度时间履历即可，是不同温度下货架期计算的有效和简单易用的工具。

本实验通过对低温(0～10℃)和室温(25℃)贮藏下鱼体感官、理化和微生物指标的系统研究，确定不同温度与货架期之间的相关性，并对货架期预测模型的性能和适用性进行评价及验证，旨在运用该模型和温度时间履历获得0～25℃范围内任何点处剩余货架期信息。同时，虽然对尼罗罗非鱼室低温贮藏期间的细菌种群进行了研究[13-16]，但室温贮藏时优势腐败菌的种类和腐败力仍然未知，因此有必要对低温和室温下优势腐败菌的差异进行研究，为探究不同温度范围内导致产品腐败的内在原因，为最大限度减少变质产品数量和改善消费时的品质分布，构建集动力学模型和温度时间履历监控于一体的高效供应链管理系统提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品制备及贮存

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)产自广东茂名地区，鲜活运输至上海铜川路水产批发市场等，运达试验室后(平均体质量：450g，平均长度：240mm)冰水冷却致死，放于高精度低温培养箱进行低温(0、3、5、8、10℃)、室温(25℃)和贮藏变温(A：0℃、136h→5℃、41h→15℃、41h→25℃、7h→8℃、48h)贮藏，贮藏期间合适间隔取样，用温度时间记录仪监控温度变化，每1h记录一次。

1.2 试剂与仪器

营养和铁琼脂琼脂培养基 上海昆虫科技开发公司；GNID和GPID测试板 英国TREK Diagnostic Systems LTD公司；假单胞菌专用培养基 英国Oxoid公司；Sensititre微生物鉴定系统 英国Trek Diagnostic System Ltd公司；自动菌落成像分析系统、拍打式均质器、全自动微生物平皿螺旋加样器 西班牙IUL公司；培养箱 日本Sanyo 公司；微生物鉴定系统 美国MIDI公司；175-T2时间温度记录仪 德国Testo公司；CX41生物显微镜 日本Olympus公司。

1.3 样品处理

低温、室温和变温贮藏的试验次数(n)，见表1。每次随机抽取3尾试样鱼，先进行生鱼感官评价，然后采用GB/T 18108－2000《鲜海水鱼》的取样方法，样品鱼去鳞去内脏去腮，洗净后沿脊骨无菌剖切，半条鱼蒸熟后用于感官评价，用均质器将另半条鱼肉打碎，进行菌落总数(total viable counts，TVC)、产H2S菌等计数，以及挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVBN)的测定。

1.4 指标测定

感官评价、TVC、假单胞菌数、产H2S菌数、TVBN和货架期判定方法参照文献[2-3,17]。

细菌鉴定：对整个平板或一定区域内所有菌落(通常30～100CFU)，依据菌落形态、革兰氏染色、细胞形态，芽孢有无，运动性及氧化/发酵等特征，采用双歧分类法进行分组，每组挑取所有菌落或若干菌落(至少2～3CFU)，分离纯化25℃培养24～48h。细菌鉴定参考文献[17-19]进行多相分类，并对优势菌株进行16S rRNA序列进行测定，PCR产物经割胶回收后交上海生工生物工程技术服务有限公司，先进行DNA克隆，由DNA自动测序仪进行测序。

1.5 相对腐败速率模型

平方根腐败速率模型起初用于评价微生物的生长，亦用于评估温度对鲜鱼货架期的影响(式(1))，RRS被定义为温度(T/℃)的腐败速率除以参考温度的腐败速率，即参考温度时货架期除以T时的货架期[10]，见式(2)。

式中：k为与反应系统物质本性有关的经验常数；T为贮藏温度/℃；Tref为参考温度；Tmin为理论最小温度。

1.6 预测模型性能评价

比较模型性能(performance)最有效的手段之一是预测值和真实检测数据进行比较，常采用决定系数(R2)、残差平方和(residual sum of squares，RSS)、偏差度(bias factor，BF)、准确度(accuracy factor，AF)、均方根误差(root mean square error，RMS)对模型的拟合优度(goodness of fit)进行评价[20]，即：

式(3)～(6)中：RSS表示随机误差的效应，用于解释变量和随机误差所产生的效应；BF和AF两者均由几何平均值得到，偏差度用来检查预测值的上下波动幅度，准确度用来衡量预测值和实测值之间的差异；当m=2时，RMS为均方根误差，可有效指示模型与数据点间的均差，被广泛用于评价模型的拟合优度。

1.7 数据处理

试验数据用Statistica(Release 5.5)统计软件(StsatSoft, Inc.)进行单因素方差分析及最小显著差异法分析，当P＞0.05时差异不显著，采用最小平方差法进行曲线拟合和评价。

2 结果与分析

2.1 0～25℃贮藏尼罗罗非鱼的品质特征

表 1 低温和室温贮藏尼罗罗非鱼品质特征和货架期Table 1 Shelf life and quality characteristics of Oreochromis niloticus stored at low and ambient temperatures

鲜品贮藏的初始阶段，品质损失主要是自溶酶等作用引起的，其后，适应贮藏环境的腐败菌逐渐占据优势地位，产生硫化物、有机酸、醛酮类等腐败产物。罗非鱼低温贮藏初始感官评价良好，菌落总数、假单胞菌、产H2S菌和TVBN分别为(4.41±1.13)、(3.39±1.09)、(2.01±0.88)(lg(CFU/g))和(8.53±0.73)mg/100g。低温(0～10℃)贮藏时货架期终点时菌落总数、假单胞菌、产H2S菌和TVBN分别为(7.79±0.35)、(7.24±0.45)、(6.35±0.23)(lg(CFU/g))和(19.90±2.10)mg/100g，无显著性差异(P＞0.05)。表1显示，室温贮藏时的货架期终点假单胞菌数处在较低水平(5.92±0.02)(lg(CFU/g))，TVBN为(24.07±0.39)mg/100g，室温下的假单胞菌数明显低于低温下的数量，而产H2S菌数高于低温时的数量，表明室温和低温过程参与腐败的细菌种类可能较大存在差异，因此，采用双歧法、数值法和16S rRNA测序法对细菌菌群进行分类鉴定。

2.2 0～25℃贮藏尼罗罗非鱼的细菌种群

表 2 低温和室温贮藏尼罗罗非鱼货架期终点细菌种群组成Table 2 Flora compositions of cultivated Oreochromis niloticus stored at low and ambient temperatures at the end of shelf life

表2所示，货架期终点时，从0～10℃冷藏样品中共分离获得255株细菌，从25℃室温贮藏样品中分离到84株菌，第1～9组依次为假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、不动细菌属(Acinetobacter spp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、水生黄杆菌(Flavobacterium aquatlis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter spp.)、棒状菌属(Corynebacterium spp)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。低温贮藏罗非鱼货架期终点时假单胞菌占主导地位(表2)，255株菌中有147株鉴别为假单胞菌，该菌为运动性的革兰氏阴性杆菌，过氧化氢酶和氧化酶阳性，不产生H2S和三甲胺，也出现了一定比例的腐败希瓦氏菌(10.2%)、嗜冷杆菌(11.4%)和少量的气单胞菌(8.6%)。气单胞菌是室温(25℃)贮藏罗非鱼的优势腐败菌，84株菌中有69株鉴定为气单胞菌，比例为82.1%，该菌具有单鞭毛，有动力，为发酵型革兰氏阴性菌，其中30株产生H2S，39株不产生H2S，对其腐败力的差异有待进一步研究。

2.3 温度特征与相对腐败速率

依据表1中数据，利用式(1)、(2)可推导出0～25℃条件下的RS和RRS，以0℃为参考温度，对0、5、10℃和25℃的RRS平方根数据进行拟合，见图1，得到R R S=(1+0.1 1 T)2(式(7))，R2=0.9 8 5 9，可推导出Tmin=－8.9℃。采用BF、AF、RRS和RMS对方程7性能进行评价，由表3可知，准确度=1.10，说明预计值和实际值之间的平均差异为10%；偏差1.0表示预计值没有系统错误，0.75～1.25被认为是可靠的[20]，依据方程3可知偏差度为1.10，表示预计值的偏差为10%，处在0.75～1.25范围内，因此该模型是可靠的。

图 1 尼罗罗非鱼平方根相对腐败速率与温度相关性Fig.1 Typical linear relationship for Oreochromis niloticus between square root of RRS and temperatures

表 3 平方根RRS模型的预测与评价Table 3 Assessment and prediction of square root RRS model

2.4 恒温和变温条件下货架期预测模型验证

依据式(7)，以0℃作为参考温度，推导出恒温下的货架期预测模型(式(8))。在生产和流通中温度变化通常是随机的，因此没有数学表达式可以用来描述时间-温度变化，剩余货架期预测方法是把时间-温度历史分割成假设为很短的温度时间区间，利用式(8)，把所经历不同温度下的时间(storage time，ST)累计为参考温度下的时间，求出与参考温度下的货架期之差，进而可以导出变温下的剩余货架期(式(9))。表4所示，利用式(8)、(9)，3、8℃恒温和变温(A：0℃、136h→5℃、41h→15℃、41h→25℃、7h→8℃、48h)的货架期的预测值分别为11.2、5.6d和9.1d，预测值与实测值相对误差分别为－13.8～－4.2%，表明该模型能较好预测恒温和变温下货架期。

表 4 恒温和变温下尼罗罗非鱼货架期预测模型验证Table 4 Validation on predicted shelf life of Oreochromis niloticus under isothermal and non-isothermal conditions

3 结 论

3.1 通过对低温(0～10℃)和室温(25℃)贮藏尼罗罗非鱼的感官、TVBN、TVC、假单胞菌数、产H2S菌数和细菌菌相等分析，确定低温下货架期为5.5～20.1d，优势腐败菌为腐假单胞菌，室温下货架期仅1.3d，优势腐败菌为气单胞菌。

3.2 采用Square-Root模型确定了不同温度下的相对腐败速率等，得到最小温度为－8.9℃，开发出罗非鱼平方根腐败速率模型，并采用R2、RSS、BF、AF和RMS对模型的拟合优度进行评价，结果显示平方根预测模型具有较好的预测性能。

3.3 构建了0～25℃范围内的货架期和剩余货架期预测模型，用3、8℃恒温和变温下的货架期进行验证，相对误差为－13.8%～－4.2%，显示平方根货架期模型的预测性能良好，在恒温和变温等实际流通链中具有实用性。

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