大鼠肝脏在四氯化碳作用下NF－κB与CXCR1表达的研究

肝纤维化是肝病的典型表现形式，作为机体的自我保护作用，是生物体抵抗损伤所进行的一种反应。但是在疾病进程中，如果肝纤维化不能得到有效控制，在患者有可能发展为肝硬化。治疗肝纤维化最有效的方法，除清除病毒，减少肝细胞损伤外，比较关键的是扭转纤维化，恢复肝脏正常结构及功能。因而，导致肝纤维化的分子机制的研究便凸显出积极的意义。但是研究发现，无论是静止期还是活动期，肝星状细胞（HSC）能够被诱导产生趋化因子。静止型HSC能够被肿瘤坏死因子TNF所诱导，从而表达MCP－1，同时在氧化应激和脂质过氧化产物的作用下，活化型HSC能够表达其他类型的趋化因子［1］。NF－κB和趋化因子在炎症反应中起着重要的作用，有大量的证据表明趋化因子及其受体在造血、血管生成、恶性肿瘤、HIV的侵染、炎症反应中起着重要的作用。然而，它们也在肝纤维化的发生中起到推波助澜的作用。但是它们在肝损伤后经历怎样的变化，目前还不是很清楚。本文就大鼠肝脏在四氯化碳损伤后研究NF－κB与CXCR1表达的变化，以期为临床治疗肝纤维化提供理论依据。

材料与方法

1 实验对象与分组 11周龄雄性健康SD大鼠30只，体重约为200g左右（购自交大医学院实验动物中心）。随机分为对照组，实验组两组。各组大鼠在相同的湿度、温度、光照条件下饲养进行适应性1周后，实验组使用植物油配置的50%四氯化碳溶液腹腔注射，对照组直接腹腔注射植物油，每周1次，共计9周。分别在第3周，第6周，第9周随机从两组中各取出5只进行病理、分子生物学方面的检查。

2 组织病理学检测 分别在第3周，第6周，第9周取材，采用10%水合氯醛（3．5mg／kg）腹腔注射，麻醉大鼠。取肝脏组织，常规石蜡包埋，切片，HE染色。照相显微镜观察并记录。

3 RT－PCR检测 取在液氮中保存的组织，加适量液氮研磨组织，再加入RNA提取液Trizol（1ml／50～100mg组织），继续研磨至匀浆形成。总RNA的量检测以RNA OD值计算，加入的量为1000ng的总RNA。普通PCR仪进行逆转录反应。GAPDH：上游：5′－CACGGCAAGTTCAATGGCACA－3′，下 游：5′－GAATTGTGAGGGAGAGTGCTC－3′；NF－κB：上游：5′－CACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC－3′，下游：5′－CCGGACTCCGTGATGTCTAAGTACT－3′；CXCR1：上 游：5′－TTGGAAATATCACCCGAATGCTG－3′， 下 游： 5′－AAGATGGCAAAAGGCAGAGAC－3′。95℃预变性结束后，进行2步PCR循环，并检测荧光信号，95℃变性5s，60℃复性延伸45s，重复40个循环。以上程序结束后，分析溶解曲线，确定产物的溶解温度，95℃完全变性10s，60℃进行复性30s，然后再升温到90℃15s，检测完毕。分析运行结果，分析并观察样本的Ct值。依据结果采用待测基因的拷贝数与内参GAPDH基因的拷贝数的比值来表示目的基因的相对表达量。

4 Western blot检测 用预冷的蛋白裂解液［含125mmol／L Tris－HCl，5% （w／v）SDS，24．75%甘油］裂解肝组织，作用时间为30min，待裂解结束后，组织匀浆移到无菌离心管，离心12000rpm，4℃，共计20 min。弃沉淀，将上清液。加入蛋白上样缓冲液于蛋白样品（4︰1），用水煮沸8min。低温冷冻离心机上离心，12000rpm，4℃，10min，取上清液。按照试剂盒的介绍方法，用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白的浓度进行检测。每孔总蛋白上样量30μg，10%SDS聚丙烯纤胺凝胶电泳2h，后转至PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭2h，用封闭液稀释一抗（NF－κB和CXCR1）到适宜浓度，将稀释的抗体加入到平皿中，用滤纸吸净从封闭液取出的PVDF膜表面的液体，吸干后膜覆盖在稀释后的抗体上，4℃过夜。抗体孵育结束后，倒掉抗体，PBST洗脱膜，每次15min，共3次。同法加入二抗，用PBST洗完之后，进行化学发光反应。β－actin作为内参。

5 统计学处理 采用SPSS10．0统计软件进行数据分析，数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P＜0．05表明差异有统计学意义。

结 果

1 病理学观察 见图1。与正常对照组相比，四氯化碳注射组随着时间的延长，大鼠的生活状态发生变化，饮食不振，精神萎靡等。在病理图片中，随着时间的延长，实验组大鼠的肝脏逐渐发生肿胀现象，和正常组相比，颜色由鲜红变为暗红色，最后，变为浅灰色，同时肝脏的体积发生萎缩现象，体积变小，同时伴随着肝脏质地变硬。从病理图片上还能发现，随着造模时间的延长，出现肝细胞水肿，轻度的脂肪变化，肝细胞点状、灶状坏死，炎症细胞增多，细胞间纤维增生。

图1 四氯化碳对大鼠肝脏的影响

2 四氯化碳对大鼠肝脏NF－κB和CXCR1mRNA表达的影响 对照组、四氯化碳处理组在3周、6周、9周组中肝脏NF－κB的mRNA相对表达量分别为：8．27×10－5，9．14×10－5，9．62×10－5，2．34×10－4；CXCR1的相对表达量分别为：8．07×10－4，1．78×10－3，2．98×10－3，4．27×10－3，可见四氯化碳处理9周组NF－κB和CXCR4的表达量显著的高于对照组，其中的NF－κB升高最为明显（图2～5）。

图2 NF－κB的扩增曲线

图3 CXCR1的扩增曲线

图4 不同处理组肝脏组织中NF－κB mRNA的相对表达水平变化

3 四氯化碳对大鼠肝脏NF－κB、CXCR1蛋白表达水平的影响 经过对免疫印迹结果进行灰度扫描，采用相应的软件分析后，经过计算发现正常对照组、四氯化碳处理3周组、6周组、9周组肝脏中NF－κB的蛋白相对表达量分别为：0．13±0．02、0．12±0．03、0．29±0．01、0．58±0．02；CXCR1的相对表达量表达量分别为：0．19±0．05、0．29±0．02、0．41±0．03、0．58±0．06。四氯化碳处理组，NF－κB和CXCR1的表达量都明显高于正常对照组。

图5 不同处理组肝脏组织中CXCR1mRNA的相对表达水平变化

讨 论

从上述结果可以看出，与对照组相比，四氯化碳处理组中NF－κB与CXCR1在肝脏中的表达无论是在mRNA的核酸水平上还是在蛋白水平上都呈现升高的趋势，虽然升高的程度有所差别，尤其是在四氯化碳处理组中的第9周组表现最为明显。通过比较发现发现NF－κB在肝脏损伤中的表达量升高的趋势明显比趋化因子受体CXCR1升高的快。大鼠肝脏在四氯化碳刺激下，大鼠肝脏中的NF－κB与CXCR1的表达量随着四氯化碳的作用时间延长而呈现出升高趋势，在两者共同作用下，同时在其他的炎症因子或者炎症抑制因子的共同作用下，在肝脏受到损伤时，起到积极的保护作用。

研究发现，当大鼠的肝细胞在CCl4的刺激下，在细胞中能够产生单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1），而且该因子被证实主要在HSC中表达［2］。HSC在趋化因子的作用下，参与了肝组织损伤和修复的一系列反应，在肝慢性炎症和纤维化形成中发挥着重要的作用。大量的研究证实，炎症不仅是与慢性肝病联系密切，同时他还能极促进疾病进展［3－5］。大于80%的肝癌患者伴随着发生肝硬化或纤维化，从而在慢性肝细胞损伤、再生，炎性细胞的渗透作用和活化的肌成纤维细胞的丰度方面有这一定的发展［6］。

NF－κB在不同的细胞组成中具有广泛的功能，能够影响肝细胞的存活，枯夫细胞的炎症反应以及造血干细胞细的存活，炎症反应及细胞活性。NF－κB在肝脏中所担负的关键角色已被证实，通过基因敲除小鼠模型中的一些NF－κB调节因子，从而导致肝脏的自发性肝损伤，肝纤维化和肝癌。该研究不仅能够突出NF－κB在肝脏疾病过程的重要作用，同时也能够揭示也强调肝损伤，炎症，纤维化和肝癌之间潜在的分子机制。

肝纤维化是不同致病因素导致的慢性肝损伤的结果。虽然肝纤维化通常在停止伤害后反转，但是如果这种病得不到及时治疗，任其继续发展，最终会导致肝硬化，这种情况通常是无法改变的［6］。多种炎症介质基因的启动子和增强子中存在一个或多个κB序列，如 TNF－α、IL－1、IL－2、IL－6、IL－8、G－CSF、GM－CSF、ICAM－1、VCAM－1（血管细胞粘附分子）、ELAM－1（内皮细胞白细胞粘附分子）等。活化的NF－κB则参与它们的基因表达，引起多种细胞因子的表达增高，参与调节免疫反应及炎症过程。NF－κB调节肝纤维化的发生主要是通过三个不同的方面来进行：①通过对损伤的肝细胞进行调节，对肝脏纤维化做出一定的响应；②通过调节炎症信号通路，激活肝脏中的巨噬细胞和其他炎症细胞；③通过调节造血干细胞中的纤维化反应。综上所述，NF－κB活性在肝脏中的减少或缺失致肝细胞损伤和随后的纤维化程度的增加。在本实验中，通过四氯化碳作用引起大鼠肝损伤，从病理切片中能够明显的观察到相关的现象，同时通过在核酸和分子水平上进行检测，发现NF－κB和趋化因子受体的表达水平上都发生变化，虽然变化程度不一样，但是通过统计学分析，两者呈正相关性。

白介素－8受体α是趋化因子受体，主要表达在免疫细胞，包括中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞以及上皮细胞、成纤维细胞等结构细胞表面上。是具有7次跨膜域的受体，属G蛋白偶联受体（GPCR）超家族成员，与配对的趋化因子结合，通过G蛋白变构激活下游的效应分子进行信号转导，实现生物学功能。按照结构可分为CXCR、CCR、CR和CX3CR四个亚类。CXCR1是CXCR家族的主要成员之一，主要表达于中性粒细胞、单核细胞、T细胞等细胞表面，在多种炎症性疾病中发挥重要作用。此外，该受体激活可以调节细胞发育、血管生成等作用。Murdoch等［7］研究发现，在HBV导致肝硬化患者，病毒除导致肝细胞坏死诱发炎症因子大量产生，并且诱导受染肝细胞及血管内皮细胞等大量分泌IL－8，CXCR1作为IL－8受体，其可能参与乙肝慢性化及肝硬化疾病进程。王健等［8］研究也提示HBV感染后肝硬化患者外周血CXCR1mRNA表达上调。推测CXCR1在参与HBV介导的致炎分子作用。通过控制HBV复制或阻断CXCR1表达可使肝硬化患者炎性反应减轻，阻止或延缓纤维化的发生。本研究结果也表明，在四氯化碳引发肝细胞损伤后，CXCR1的表达无论是基因水平还是蛋白水平均提高，并且随着损害时间的延长，其表达进一步增高，因而可以认为其参与损伤后的修复，进而导致后期肝纤维化的发生。

综上所述，当肝脏受到损伤后，大鼠体内的NF－κB和CXCR1无论是基因还是蛋白均增高，可见两者都参与了大鼠的肝脏损伤保护或者加重肝纤维化，为进一步揭示肝脏在损伤条件下的肝纤维化机制提供了积极的理论基础，同时为治疗肝脏损伤所引起的一系列疾病提供了一种手段，为研究新型药物治疗肝损伤提供一定的理论依据。

［1］ Sprenger H，Kaufmann A，Garn H，et al．Differential expression of monocyte chemotactic protein－1 （MCP－1）in transforming rat hepatic stellate cells［J］．J Hepatol，1999，30：88－94．

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［6］ Wasmuth HE，Tacke F，Trautwein C．Chemokines in liver inflammation and fibrosis［J］．Semin Liver Dis，2010，30：215－25．

［7］ Murdoch C，Finn A．Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious desease［J］．Blood，2000，95（10）：3032－3033．

［8］ 王 健，毕惠娟．肝硬化患者外周血CXCR1、CXCR2表达及其与血清ALT、AST水平的相关性［J］．中国病原生物学杂志，2012，7（11）：823－827．