诱导型一氧化氮合酶对二甲氧乙二酰甘氨酸预处理晚期肾保护作用的影响

陆文俊 张晓丽 叶志斌 夏世金

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一种常见的临床危急重症，普通住院患者发病率为2% ～7%，重症监护室中的发病率则高达10% ～30%。虽然临床上针对AKI 采取了一系列的防治措施，但该病的病死率仍高达30% ～80%。肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是AKI 的最常见病因，至今缺乏有效防治手段［1］。低氧诱导因子(hypoxia induced factor 1α，HIF-1α)是调节细胞适应性反应的核心调控因子［2-3］。我们前期研究发现，脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases domain-containing protein，PHD)抑制剂二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxallyl glycine，DMOG)预处理可稳定肾小管上皮细胞HIF-1α 表达，减轻肾IRI［4-5］，但关于其晚期肾保护作用及其机制研究尚未见报道。本研究旨在证实DMOG 预处理对小鼠肾IRI 的晚期保护作用，并利用诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric-oxide synthase，iNOS)特异性抑制剂干预的方法探讨iNOS 在此过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性C57BL/6N 小鼠24 只，体质量22 ～26 g(SPF 级，中科院上海实验动物中心)，随机分为4 组:假手术(sham)组、IRI 组、DMOG 预处理组(DMOG + IRI)和GW274150 干预组(GW274150+DMOG+IRI)，每组各6 只。

1.2 模型制作 2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，取腹正中切口，钝性分离肾蒂，无创动脉夹夹闭双侧肾蒂造成肾缺血，持续夹闭30 min 后松开动脉夹，恢复血流，观察1 min，肾脏由暗紫色逐渐转为鲜红色，表明再灌注成功，缝合伤口。sham 组只分离肾蒂，然后关腹;DMOG 预处理组在缺血术前24 h 腹腔注射DMOG (40 mg/kg，Cayman 公司，美国);GW274150 干预组在DMOG 预处理后的术前30 min予腹腔注射iNOS 特异性抑制剂GW274150(10 mg/kg，Enzo Life Sciences，美国)。缺血再灌注24 h 后，采血并处死小鼠，留取肾组织备用。

1.3 指标检测

1.3.1 肾功能检测:眶下静脉丛采血，分离血清，酶法测定小鼠血清肌酐(SCr)浓度(日立全自动生化分析仪)。

1.3.2 肾组织病理学检查:10%中性甲醛固定肾组织，制作石蜡切片，常规HE 染色，显微镜下观察肾脏病理改变。根据肾小管细胞扁平、管腔扩张、细胞脱落坏死、肾小管管型堵塞、间质水肿，炎症细胞浸润及出血等观察肾小管间质损伤情况。

1.3.3 Western blot 检测:分别提取组织核蛋白和总蛋白，BCA 法测定组织蛋白浓度。行PAGE 电泳、转膜、封闭后，鼠抗HIF-1α 单克隆抗体(Novus Biologicals 公司，美国)或兔抗iNOS 多克隆抗体(Cell Signaling Technology 公司，美国)或兔抗Actin 多克隆抗体(Sigma-Aldrich，美国)4 ℃孵育过夜，TPST 洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔lgG(Jackson公司，美国)37 ℃孵育1 h，曝光、显影、成像。应用图像分析软件对HIF-1α 和iNOS 特异性条带进行吸光度分析。

1.3.4 细胞凋亡的检测:采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Tunel 法)，按试剂盒(Roche公司，德国)说明书进行操作。每一切片选取10 个视野，在200 倍光镜下，盲法观察染色阳性细胞数。

1.4 统计学分析 数据采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差(±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肾功能测定 与sham 组相比，IRI 组小鼠SCr 明显升高;DMOG 预处理可降低IRI 小鼠的SCr 水平;然而，如果在IRI 前事先应用iNOS 特异性抑制剂GW274150 可使DMOG 预处理小鼠SCr 升高。见表1。

2.2 各组小鼠肾脏病理学改变 HE 染色结果显示，IRI 组小鼠肾组织病理学改变明显，受损部位集中在外髓内带的近端小管，主要表现为刷状缘脱落，肾小管细胞扁平、脱落，管腔扩张，肾小管管腔内被管型堵塞，间质水肿，炎症细胞浸润和出血;DMOG 预处理组肾组织病理学改变较IRI 组显著改善;iNOS 特异性抑制剂GW274150 干预则使DMOG 预处理小鼠肾组织损伤加重。见图1。

图1 4 组小鼠肾组织病理光镜下改变(HE，×200)

2.3 各组小鼠肾组织细胞凋亡的检测 结合苏木素染色结果显示，sham 组小鼠肾组织肾组织中仅见少量肾小管上皮细胞凋亡;IRI 组小鼠肾小管上皮细胞呈现出明显的凋亡迹象，凋亡细胞主要集中在皮髓交界、髓质，DMOG 预处理组肾组织细胞凋亡数目较IRI 组明显减少;iNOS 特异性抑制剂GW274150 干预可使DMOG 预处理小鼠肾组织细胞凋亡数目增加。见图2及表1。

图2 各组小鼠肾组织细胞凋亡情况(×200)

2.4 DMOG 预处理24 h 后小鼠肾组织中的HIF-1α蛋白的表达 小鼠予腹腔注射40 mg/kg 的DMOG 进行预处理，24 h 后小鼠肾组织中HIF-1α 蛋白表达较注射磷酸盐缓冲液的对照小鼠明显增加［(2.36 ±0.25)%比(0.57 ±0.06)%，P ＜0.05］。见图3。

图3 HIF-1α Western blot 检测结果

2.5 4 组小鼠肾组织中iNOS 蛋白的表达 sham 组几乎没有iNOS 表达，IRI 组iNOS 表达增加，DMOG 预处理后iNOS 进一步增加，DMOG 预处理前予iNOS 特异性抑制剂GW274150 可减弱iNOS 的表达。见图4及表1。

图4 iNOS Western blot 检测结果

表1 各组小鼠SCr 水平、肾组织细胞凋亡水平及iNOS 蛋白的表达(±s，n=6)

表1 各组小鼠SCr 水平、肾组织细胞凋亡水平及iNOS 蛋白的表达(±s，n=6)

注:与sham 组比较，△P ＜0.05;与IRI 组比较，* P ＜0.05;与GW274150干预组比较，#P ＜0.05

组别SCr(μmol/L) 细胞凋亡(%)iNOS/Actin sham 组9.8 ±2.22.6 ±1.30.21 ±0.03 IRI 组238.7 ±32.5△ 26.0 ±3.6△ 0.78 ±0.16△DMOG 预处理组12.3 ±3.6* #8.2 ±1.5* # 1.62 ±0.25* #GW274150 干预组162.2 ±31.417.3 ±2.51.09 ±0.18

3 讨论

过去的20 年中，人们对细胞缺血缺氧环境下的适应性反应进行了不少研究，但其机制仍未完全阐明。HIF-1 是哺乳动物细胞低氧应答的核心调节因子，由α亚基和β 亚基组成，其中α 亚基是低氧调控的功能性亚基。常氧条件下，HIF-1 极不稳定，通过脯氨酸羟化酶羟基化启动泛素-蛋白酶体途径迅速发生降解;缺氧条件下，脯氨酸羟化酶功能丧失，阻断了HIF-1α 羟基化降解，积聚的HIF-1α 转位入核，与HIF-1β 结合，启动一系列下游功能基因的转录表达，以适应低氧环境。截止目前，已发现受其调控的靶基因多达百余种，它们在血管新生、糖代谢及细胞生存、增殖和凋亡等过程中发挥极其重要的作用［6-7］。我们前期研究证实，通过预处理稳定肾小管上皮细胞HIF-1α 的表达，可以模拟缺血预适应，增强肾小管上皮细胞对IRI 的耐受，减轻肾小管上皮凋亡，其机制可能与HIF-1α 激活后促进了一系列保护基因如血红素氧合酶-1(heme oxygenase，HO-1)、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)和热休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)的转录表达有关［4-5］。

缺血预适应的保护作用具有双时相性，根据时间早晚分为早期缺血预适应和晚期缺血预适应。早期缺血预适应在预缺血几分后即可出现，一般持续2 ～4 h;晚期缺血预适应在缺血预处理12 ～24 h 后出现，能持续几天甚至数周［8］;同样，药物预处理也存在这种晚期肾保护作用，但关于DMOG 晚期肾保护作用及其机制研究尚未见报道。本实验表明，DMOG 通过改善IRI小鼠的肾功能，减轻肾组织病理学损伤，减少肾组织细胞凋亡，对小鼠肾IRI 产生晚期保护作用。

机体中存在3 种一氧化氮合酶:内皮型(endothelial NOS，eNOS)、神经型(neuronal NOS，nNOS)和诱导型(iNOS)。iNOS 刺激后释放一氧化氮(NO)较慢，持续时间长，既往研究证实，iNOS 是晚期预适应的触发和调节因子，它参与了缺血预处理及多种药物预处理的晚期心、肾保护作用［8-10］。GW274150 是一种特异性iNOS 抑制剂，对于其他2 种一氧化氮合酶几乎没有作用。本实验中通过Western blot 方法检测了iNOS 在各组小鼠肾组织中的表达，结果发现，IRI 组存在一定程度的iNOS 表达，DMOG 预处理后iNOS 增加更加明显，而DMOG 预处理后予GW274150 可明显减弱小鼠IRI 肾组织中iNOS 的表达。由此说明，iNOS 特异性抑制剂GW274150 可大大削弱脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG 对小鼠IRI 的晚期保护作用。

iNOS 主要通过合成NO 来发挥作用。NO 可以激活鸟苷酸环化酶，产生环鸟苷酸(cGMP)，进而激活蛋白激酶G 并通过开放线粒体钾通道而产生肾保护作用［8］。值得指出的是，低水平的NO 对肾脏具有保护作用，而过高水平的NO 将对肾脏具有损伤作用，我们推测DMOG 预处理恰恰是产生了中等程度的iNOS/NO，进而启动保护性信号途径对抗之后的肾IRI。另外，有报道，常氧条件下，NO 供体可刺激HIF-1α 表达［11］。因此，我们推测DMOG 预处理可稳定HIF-1α，促进HIF-1α 靶基因iNOS 表达，使NO 合成增多，进而通过阳性反馈作用进一步触发HIF-1α 活化，放大其肾保护作用。

总之，本研究提示了DMOG 预处理对小鼠IRI 肾脏产生晚期保护作用，iNOS 特异性抑制剂可削弱这种保护性作用，这意味着iNOS 参与了HIF-1α 活化引发的肾保护作用。

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