基因芯片结核分枝杆菌耐多药检测在地市级实验室的应用性评估

赵冰 时金艳 逄宇 夏辉 李强 欧喜超 宋媛媛 王玉峰 池俊英 赵雁林

·论 著 ·

基因芯片结核分枝杆菌耐多药检测在地市级实验室的应用性评估

赵冰 时金艳 逄宇 夏辉 李强 欧喜超 宋媛媛 王玉峰 池俊英 赵雁林

目的 评估基因芯片耐多药检测利福平、异烟肼和耐多药肺结核（MDR-TB）的效能，探讨在地（市）级实验室应用基因芯片的可行性。方法 对2011年1月1日至2012年3月31日在江苏省连云港市涂片阳性的745例患者痰标本进行基因芯片检查，去除传统培养和非结核分枝杆菌等原因的111例，以传统药敏为金标准，在634例患者中分析对利福平、异烟肼和MDR诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果 评估结果表明基因芯片对于利福平检测的敏感度和特异度为84.4%（65/77）和97.7%（544/557）；对于异烟肼的敏感度和特异度分别为80.9%（76/94）和97.4%（526/540）；对于MDR的敏感度和特异度分别为70.0%（42/60）和98.3% （564/574）。基因芯片和传统药敏检测一例涂阳患者的成本分别为165.65元和374.07元。结论 基因芯片检测方法是一种在中国基层实验室值得推广的更高效、快捷、安全，以及更符合成本-效益的耐药结核病诊断方法。

分枝杆菌，结核； 抗药性，多种，细菌； 寡核苷酸序列分析； 实验室，医院； 评价研究

结核病仍然是全世界公共卫生面临的重大威胁［1］。耐多药（同时对利福平和异烟肼耐药）结核病和艾滋病被认为是结核病控制的最大难题。特别是在发展中国家，耐多药结核病的疫情非常严重，全世界每年新发的44万例耐多药结核病患者中，有约1/2的患者来自于印度和中国［2］。由于结核分枝杆菌的低生长速率，传统的细菌学药敏试验约需2～3个月才能获得诊断结果，即便选用快速液体培养技术，也需要大约1～2个月时间获得药敏试验结果［3］。这就导致了诊断的延迟，同样不利于对患者开展有效的治疗，并加速了耐药结核病的传播。因此，如何快速完成对结核病患者，特别是耐药结核病患者的诊断是一个亟需解决的问题［4］。

基因芯片耐多药检测技术通过检测标本中结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因的突变情况，从而判定对利福平和异烟肼的耐药性［5］。早先文献对其评价的结果表明，上述技术具有较理想的效能，其中对于临床标本利福平和异烟肼检测的敏感度分别为94.6%和78.1%［5］。目前尚缺乏基因芯片技术在地市级实验室评估的数据，因此有必要在地（市）级结核病防治（简称“结防”）机构实验室开展评估，不仅弥补之前评估样本的不足，同时为我国推广该种技术提供理论依据。本研究目的为：在条件有限的地（市）级实验室评估基因芯片检测利福平和异烟肼耐药性的效能，从而为其进一步推广提供数据。

材料和方法

一、研究设计

从2011年1月1日至2012年3月1日，选取江苏省连云港市作为项目实施地区，连续纳入了项目地区所辖区县发现的所有涂阳肺结核患者，每例患者要求提供2～3份痰标本，每份标本不少于2 ml；各区县结防机构在收集痰标本3 d内将标本送往地（市）级实验室。项目地（市）级实验室选取同一份痰标本同时进行传统培养药敏试验和基因芯片检测。

二、患者纳入

本评估项目总共纳入了745例涂阳肺结核患者。在所有进行培养的标本中，有61份培养阴性（8.2%，61/745）和5份培养污染（0.7%，5/745），在进行传统药敏和菌种鉴定过程中，有17份（2.3%，17/745）菌种鉴定结果为非结核分枝杆菌，此外还有12份（1.6%，12/745）标本传统药敏结果失败，因此最后获得可用于分析药敏结果者650例。在进行芯片检测的标本中，分别有未检测到结核分枝杆菌45例，非结核分枝杆菌15例及无法判读结果16例，分别占总检测标本的6.0%、2.0%和2.1%，总计获得可用于分析基因芯片结果者669例。综合传统药敏结果和基因芯片结果，总计有634例患者的检测结果可用于分析基因芯片对于耐药的检测性能。

三、仪器和培养基

北京博奥生物有限公司生产的基因芯片检测系统、结核分枝杆菌耐多药基因芯片检测试剂盒；珠海贝索生物技术有限公司生产的罗氏培养基及药敏培养基。

四、实验室方法

地市级实验室使用 N-乙酰半胱氨酸和氢氧化钠溶液（NALC-NaOH）消化一份阳性级别较高的标本。消化液接种于改良罗氏培养基中，待4～8周后刮取菌落并按照文献［6］的要求进行传统药敏试验和菌种鉴定。

吸取1.2 ml消化液于1.5 ml离心管中，在离心半径16 cm，12 000 r/min离心15 min后，使用PBS缓冲液洗涤；并再在离心半径16 cm，12 000 r/min离心5 min后按照公司提供的说明书进行基因芯片操作［5］。

连云港第四人民医院实验室人员经过国家参比实验室培训和认可，并且在项目正式实施前进行了为期6个月的试运行，以保证项目实施人员操作的熟练度。

五、成本分析

在项目实施期间，根据文献报道［7］，采取“要素法”进行成本分析：收集不同检测整个过程所有直接和间接成本，各要素包括：（1）管理费：维持实验室正常运转的基本费用，如水、电、办公费、清洁、废弃物和垃圾处理、安保等。（2）建筑费：实验室建筑、改造及维修费用。（3）设备费：仪器设备购买、维修、维护费用。（4）人员费：从事检测相关人员工资、福利、津贴费用。（5）试剂费：检测相关试剂费用。（6）耗材费：耗材及个人防护相关费用。

六、伦理学

本研究经过中国疾病预防控制中心和美国帕斯适宜卫生科技组织伦理委员会的批准，并且所有纳入项目的患者须在纳入项目前签署知情同意书。

七、统计学处理

所有原始数据在经过国家参比实验室复核后，录入到SPSS 15.0中作为数据库，并用SPSS 15.0软件对数据库数据进行整理分析，其中统计学检测选用趋势卡方检验，仅当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

结 果

一、基因芯片检测利福平耐药性效能分析

基因芯片能够同时完成对结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性的检测。对于利福平耐药性检测而言，在检测的634例患者中，有609例患者的传统药敏结果与基因芯片结果一致，一致率为96.1%；其中在利福平传统药敏耐药的77例患者中，基因芯片检测到65例，敏感度为84.4%；在利福平表型敏感的557例中，基因芯片检测到544例，特异度为97.7%；此外，基因芯片检测利福平耐药性的阳性预测值和阴性预测值分别为83.3%（65/78）和97.8% （544/556）（表1）。

表1 基因芯片对结核分枝杆菌利福平耐药性诊断效能的分析（例）

二、基因芯片检测异烟肼耐药性的效能分析

在同时具有传统药敏试验和基因芯片检测的634例患者中，有602例患者的传统药敏试验和基因芯片检测对异烟肼耐药性的诊断结果相同，一致率为95.0%；其中，对于94例传统药敏试验异烟肼耐药的患者而言，基因芯片检测正确诊断出76例，其相应的敏感度为80.9%；此外，在传统药敏试验异烟肼敏感的540例患者中，基因芯片检测成功检出526例，其检测特异度为97.4%。在检测的634例患者中，基因芯片检测异烟肼耐药性的阳性预测值和阴性预测值分别为84.4%（76/90）和96.7% （526/544）（表2）。

表2 基因芯片对结核分枝杆菌异烟肼耐药性诊断效能的分析（例）

三、基因芯片检测耐多药结核病分析

综合基因芯片检测和传统药敏试验对患者利福平和异烟肼诊断的结果，笔者统计了基因芯片检测和传统药敏试验对耐多药结核病诊断的效果，结果如表3所示。其中，有606例（95.6%）患者基因芯片检测与传统药敏试验诊断结果一致。在传统药敏试验诊断的60例耐多药结核病患者中，基因芯片检测成功检出了42例，敏感度为70.0%；在传统药敏试验诊断的574例非耐多药结核病患者中，基因芯片检测成功检出了564例，特异度为98.3%。本评估结果中，基因芯片检测耐多药结核病患者的阳性预测值和阴性预测值分别为80.8%（42/52）和96.9%（564/582）。

表3 基因芯片对耐多药结核分枝杆菌诊断效能的分析（例）

四、标本结核分枝杆菌阳性级别对基因芯片结果影响

标本结核分枝杆菌阳性级别（简称“阳性级别”）表示标本中结核分枝杆菌浓度的水平，可能对基因芯片的结果产生影响。为此，笔者统计了不同阳性级别标本中检测结果为无法判读和无分枝杆菌的比率，结果表明，随着标本阳性级别的提高，无结果比率不断降低，其中实际条数和“++++”标本中无结果比率分别为20.5%和2.1%，标本的阳性级别与无结果比率呈现出较高的相关性（χ2=18.919，P＜0.01）（表4）。

五、基因芯片检测和传统药敏试验成本分析

使用基因芯片检测完成1例涂阳患者的成本为165.65元，而使用传统药敏试验完成1例的成本为374.07元，传统药敏试验检测成本为基因芯片的2.26倍。其中基因芯片检测成本中试剂费最高，占总成本的56.5%，其次为耗材费和管理费，分别占总成本的17.8%和17.1%。在传统药敏检测成本中，试剂费、管理费和耗材费在总成本中所占比重较高，分别占36.9%，24.1%和22.2%（表5）。

表4 标本阳性级别对基因芯片检测结果的影响

表5 基因芯片检测和传统药敏试验成本比较 （元，人民币）

讨 论

一、基因芯片诊断耐药结核病的效能评价

基因芯片耐多药检测试剂盒是一种可以应用于结核分枝杆菌耐药性检测的方法，特别是它可以直接应用于痰及其他临床标本的检测［5］。但是，到目前为止，罕有关于其在地（市）级实验室基于临床痰标本的大规模评估，特别是在耐药结核病高负担地区进行的评估［9］。近期一项在地（市）级实验室对基因芯片的评估结果表明，其检测利福平耐药性的敏感度和特异度分别为90.5%～91.2%和91.5%～98.4%；检测异烟肼耐药性的敏感度和特异度分别为69.0%～92.6%和87.0%～93.7%［7］。本研究结果与其结果比较接近，暗示在中国基层实验室中，这种检测方法在检测结核分枝杆菌药物敏感性时具有较好的敏感度和特异度。

二、基因芯片与同类检测方法的比较

基因芯片和线性探针技术同属于利用反向杂交检测结核分枝杆菌耐药相关基因的检测技术，因此，从理论上讲两者具有较类似的性能。先前研究中对线性探针技术进行了大量的评估，一篇 Meta分析结果表明［10］，线性探针检测利福平的总敏感度和特异度分别为98.4%和98.9%，异烟肼为88.7%和99.2%，均高于本研究中的结果。而另一篇在国内进行的对线性探针的评估结果与本研究结果相似［11］。导致这种差异的主要原因可能包括以下几方面：首先，用于Meta分析的评估结果均源自于较高级别参比实验室，而本研究中的实验室均为基层地（市）级实验室，因此，实验室条件的限制以及实验室人员进行实验经验的不足可能影响评估结果；其次，本研究中同样发现大量检测样品中基因型和表型结果不一致的情况，这可能与本评估中选用固体药敏试验，而非之前文献主要采用的更敏感的液体药敏试验有一定关系。

三、基因芯片诊断耐药结核病的优势

与传统药敏方法相比，基因芯片具有诸多优点。首先，基因芯片检测更快捷，能够在6 h内完成整个检测过程，因此可以为临床制定有效的化疗方案节省时间；其次，本方法是基于结核分枝杆菌核酸的检测，而非针对大量结核分枝杆菌的操作，因此，基因芯片比传统药敏试验更安全；再次，基因芯片的通量较高，可以节省实验室工作人员的时间。

四、标本阳性级别对基因芯片结果的影响分析

痰标本的阳性级别是表明痰标本中分枝杆菌含量的一个有效指标，由于基因芯片检测方法基于对标本中结核分枝杆菌相关耐药基因的扩增，因此不同阳性级别的标本可能对其结果产生影响，本研究发现随着阳性级别不断提高，无结果比例显著降低，特别是在“实际条数”样本中，无结果比率高达20.5%，这也就暗示大家基因芯片检测对于实际条数级别标本的检测结果可能在实际临床使用过程中需要慎重考虑。同时笔者也在部分高阳性级别的标本中发现无检测结果的情况，其中阳性级别为“++++”的标本中检测无结果比率为2.1%，这主要可能是由于部分标本为血痰或干酪样痰，其中蛋白含量较高，可抑制基因芯片的扩增反应，从而影响了结果的可读性。然而，标本的阳性级别对诊断结果的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值方面影响不大，表明基因芯片检测所获得结果具有较高的准确性。

本研究评估结果表明，在基层实验室中基因芯片检测对于利福平和异烟肼耐药性诊断方面具有较高的敏感度和特异度，并且成本更低，是一种值得在中国基层实验室推广的更高效、更快捷、更安全，以及更符合成本-效益的耐药结核病的诊断方法。

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Evaluation of genechip in detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in the prefectural-level laborato-ry

ZHAO Bing*，SHI Jin-yan*，PANG Yu，XIA Hui，LI Qiang，OU Xi-chao，SONG Yuan-yuan，WANG Yufeng，CHI Jun-ying，ZHAO Yan-lin.*National Center for Tuberculosis Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

ZHAO Yan-lin，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the performance of genechip in detecting rifampicin resistant，isoniazid resistant and multidrug-resistant tuberculosis（MDR-TB），and to analyze the feasibility of genechip application in the prefectural-level TB laboratory.Methods The sputum samples collected from 745 smear positive TB patients detected in Lianyungang city from January 1st 2011 to March 31st 2012 were applied by both genechip and conventional drug susceptibility testing（DST）.Out of 745 TB patients，111 were excluded due to negative culture result and non-tuberculous Mycobacteria.The conventional DST results were served as the gold standard，the sensitivity，specificity，positive predictive value（PPV）and negative predictive value（NPV）were analyzed among 634 TB patients.Results The results showed that the sensitivity and specificity of genechip were 84.4%（65/77）and 97.7%（544/557）for rifampicin resistance，80.9%（76/94）and 97.4%（526/540）for isoniazid resistance and 70.0%（42/60）and 98.3%（564/574）for MDR respectively.The costs of genechip and conventional DST for detecting one smear positive TB patient were 165.65 yuan and 374.07 yuan，respectively.Conclusion Genechip is a more effectient，rapid，safer and more cost-effective diagnosis tool for drug-resistant tuberculosis in Chinese primary laboratories.

Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance，multiple； Oligonucleotide array sequence analysis； Laboratories，hospital； Evaluation studies

2013-07-08）

（本文编辑：薛爱华）

中国卫生部与比尔及梅琳达·盖茨基金会结核病防治项目（2009-04-01）

102206北京，中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心（赵冰、逄宇、夏辉、李强、欧喜超、宋媛媛、王玉峰、池俊英、赵雁林）；连云港市第四人民医院（时金艳）

赵雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

注：赵冰和时金艳为并列第一作者