盐酸苯肼诱发小鼠网织红细胞条件的优化

曹玲玲，何 超，薛建有，毛群铨，施鸣铭，戚武林，张世馥

(浙江理工大学生命科学学院蛋白质组学与分子酶学研究室，浙江杭州 310018)

网织红细胞是研究胞质因子调控细胞分化的理想材料［1，2］，虽然细胞核已排出，但却富含调控恶性肿瘤生长和逆转的胞质因子，细胞内无溶酶体以及分裂相关的细胞器，却又具有合成蛋白质的能力，富含次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase，HGPRT)。网织红细胞不同于使用细胞松弛素B处理产生的无核细胞［3］，这样的处理使细胞受到损伤。因此，网织红细胞在红系终末分化的研究中具有重要的作用。由于正常体内的网织红细胞数量较少，不易获取足够量的细胞，所以大都采用体外诱发的方法［4－6］。结果发现不同条件诱发的网织红细胞对实验结果影响很大，因此有必要对盐酸苯肼诱发网织红细胞的方法进行优化。本实验利用小鼠对盐酸苯肼的注射剂量和注射时间进行优化，建立诱发网织红细胞的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 网织红细胞的诱发

SPF级ICR雄性小鼠和BALB/c雄性小鼠［杭州师范大学实验动物中心，SCXK(浙2011-0048)］，体质量均在25～35 g，盐酸苯肼(华东医药股份有限公司)用0.85%氯化钠注射液配成1%的工作液，避光保存，给实验组小鼠每天背部皮下注射1%盐酸苯肼，剂量分别为:100、200、300 和400 μL，连续注射9 d，每组各5只。

1.2 网织红细胞的获取及煌焦油蓝染色

每天经尾静脉取小鼠血约20 μL，重悬于200 μL无酚红的RPMI-1640培养基中。染色时取20 μL重悬细胞液与20 μL煌焦油蓝(煌焦油蓝，华东医药公司，配制成1%的染液:1 g煌焦油兰，0.5 g柠檬酸三钠，溶于100 mL 0.85%氯化钠注射液中，溶解后过滤，保存)染液混合均匀，15 min后即可在显微镜下观察。

2 结果

2.1 注射不同剂量药物对动物生存影响

ICR小鼠:注射100和200 μL药物剂量的均存活;注射300 μL药物剂量的于第6天全部死亡;注射400 μL药物剂量的第4天全部死亡。BALB/c小鼠:注射100 μL药物剂量的均存活;注射200 μL药物剂量的于第6天全部死亡;注射300、400 μL药物剂量的第3天全部死亡。

2.2 网织红细胞诱发结果

2.2.1 注射剂量对网织红细胞诱发率的影响:注射100和200 μL盐酸苯肼的ICR小鼠网织红细胞的最高诱发率分别55.25%±4.34%和83.16%±3.41%，且细胞状态良好。300和400 μL剂量组的网织红细胞最高诱发率分别76.41%±0.45%和68.51%±2.49%，动物经解剖发现，肝脏异常，颜色发暗，且脾脏肿大。此外，200 μL药物剂量组网织红细胞诱发率第4天最高，且大于100、300和400 μL药物剂量组，但从第5天开始，外周血中网织红细胞比例 (76.03%±0.99%)开始下降，成熟红细胞数量增多。

2.2.2 注射时间对网织红细胞诱发率的影响:注射第1～3天，网织红细胞比例不断增加，诱发效率高达76.41%±0.45%，第4和第5天很少或几乎看不到正常成熟红细胞，诱导率分别达到83.16% ±3.41%和76.03% ±0.99%，从第6天开始网织红细胞比例逐渐降低，之后出现成熟红细胞，网织红细胞比例降到25.81% ±1.35%(图1)。

图1 小鼠红细胞的煌焦油蓝染色Fig 1 The red blood cells in mice by bright tar blue staining(×400)

3 讨论

盐酸苯肼是一种可以导致小鼠贫血的化学药物，其作用于骨髓造血细胞，导致红系分化进程终止在网织红细胞阶段。不同的注射剂量，导致动物的健康状态有很大差别，从而影响网织红细胞的细胞状态。本实验中，注射高剂量(300和400 μL)的小鼠，1 d后两眼发暗，双耳、四肢和尾部均呈白色，尾部变得粗糙，整体表现出重度贫血症状，动物经解剖发现，肝脏异常，颜色发暗，且脾脏肿大。小鼠死亡的原因可能是过量的药物使得肝、脾衰竭、坏死，结果与过量注射盐酸苯肼的新西兰大白兔类似。由于器官衰竭，健康状况恶化，所诱发的网织红细胞细胞状态也不同于正常网织红细胞，其细胞形态异常，呈不规则形状。所以不适用于网织红细胞的诱发。但实验中的低剂量组(100和200 μL)，小鼠虽表现出贫血症状，但健康状况稍好，进食、饮水均正常。所诱发的网织红细胞经煌焦油蓝活体染色，细胞形态饱满、呈规则的圆形，清晰可见颗粒状的嗜碱性RNA颗粒。故采用低剂量药物诱发的网织红细胞细胞状态良好。

从第6天开始，注射低剂量药物的小鼠其外周血细胞发生改变，比例占多数的网织红细胞数量开始减少，逐渐出现形态比较正常的成熟红细胞，且比例不断升高，所以持续注射药物的时间不宜过长。

在所有实验组中，诱发的网织红细胞经煌焦油蓝活体染色均呈现颗粒状。而正常红系分化的网织红细胞具有不同的阶段:刚完成排核的网织红细胞，煌焦油蓝活体染色时，可见丝网状物质;随着网织红细胞不断成熟，染色时可见颗粒状物质增多，到比较成熟的阶段，则完全是颗粒状的物质。这说明，采用盐酸苯肼诱发的网织红细胞是较为成熟的，并处于同一阶段，重复性好。

实验中两种品系的小鼠(远交系ICR和近交系BALB/c)对盐酸苯肼敏感性不同，在相同体重、相同剂量的情况下，ICR小鼠耐药性明显高于BALB/c小鼠，但二者诱发的网织红细胞细胞形态没有显著差异。

［1］徐冰心，刘志国，高娇，等.硝酸羟胺中毒小鼠网织红细胞的变化及意义［J］.中国工业医学，2011，2:124.

［2］薛社普，章静波，费仁仁，等.红细胞分化(去核)因子对肿瘤细胞生长分化调控的研究［J］.中国肿瘤，1992，1:8.

［3］Prescott DM，Myerson D，Wallace J.Enucleation of mammalian cells with cytochalasin B［J］.Exp Cell Res，1972，71:480－485.

［4］刘友华，薛社普.胞质因子对人早幼粒白血病细胞恶性表型和基因表达的调控作用［J］.中国科学，1987，8:853－864.

［5］J.S.博尼费斯农，M.达索，J.B.哈特佛德，等著.章静波，方瑾，王海杰，等译.精编细胞生物学实验指南［M］.北京:科学出版社，2007:392－394.

［6］郭双利，白龙川，颜卉君，等.红细胞分化因子诱导HL-60细胞排核过程中酪氨酸蛋白质磷酸化的改变［J］.生物化学杂志，1997，13:210 －215.