大鼠心室肌细胞的分离及其单通道钙电流的记录

田力，白雨轩，田宏

（喀喇沁旗医院，内蒙古赤峰024000）

大鼠心室肌细胞的分离及其单通道钙电流的记录

田力，白雨轩，田宏

（喀喇沁旗医院，内蒙古赤峰024000）

采用Langendorff灌流、Worthington胶原酶法分离大鼠心室肌细胞，应用膜片钳制技术单通道模式记录大鼠心室肌细胞的钙电流，并进行膜片钳电生理学研究.

心室肌细胞；膜片钳；单通道；钙电流记录

细胞的电活动是生命活动的基础，而这些电活动则是通过细胞膜离子通道而实现的[1]，离子通道的基本功能是通过维持离子的跨膜运动，产生生物电现象而完成的.因此研究膜离子通道的通透机制及各种离子通透性的变化对阐明细胞生物电现象和其他生命现象的机制具有重要的理论意义和应用价值[2].德国生理学家Neher和Sakmann（1976）[3]首次报道了在单个蛙骨骼纤维上，用他们独创的膜片钳制技术，记录到单通道电流.后来经过他们对该技术的改进（Hamill等1981）[1]，该技术可应用于各种细胞的离子流研究，他们的成就获得了（1991年）生理学诺贝尔奖.

膜片钳技术一直是研究离子通道的主要技术，它使得我们能够在单个的细胞上观察单个的离子通道电活动，对离子通道的认识向前跨进到了分子水平[4].目前，膜片钳技术已广泛应用于生理、生物、药理学等生命研究领域，对其发展起到了重要的作用.心脏的电学活动一直被人们所关注，单个心肌细胞分离的成功，以及这一技术的推广，为在单个心肌细胞上进行研究提供了条件.因此本研究在以往方法的基础上对大鼠心室肌细胞分离方法进行摸索和完善，并记录观察了所获细胞的钙电流单通道记录.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠，体重300～500g.

1.1.2 主要试剂

KOH，NaH2PO4，KHPO4，NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaOH，Glucose和Taurine均为国产市售分析纯试剂，Glutamicacid和HEPES购自Amresco公司，EGTA购自日本DOJINDO公司，Protease购自sigma公司，Worthington胶原酶购自worthington biochemicalcorporation.

1.1.3 主要仪器

（2）造成系统电压发生闪变。对于分布式电源而言，其启停均会受到一系列因素（如用户实际用电量等）的影响，即具有很高的不确定性，如此一来，也就加大了系统电压闪变的几率和影响。除此之外，当分布式电源提供的输出量发生瞬间突变时，也将会引发系统电压闪变的问题。

Langendorff灌流装置，恒温水浴锅，小动物呼吸机，量筒，烧杯.

1.1.4 单通道膜片钳技术记录钙电流

1.1.4.1 仪器：倒置显微镜(Olympus)、Axopatch200B放大器(Axon公司)、数模转换器(Axon公司)、微电极拉制仪(Sutter公司)、pClamp10软件等.

1.1.4.2 试剂:灌流液为基础细胞内液(mM):Aspartic acid100,KOH100,KCl30,MgCl20.5,EGTA1,Ca-Cl20.5,HEPES-KOH10，pH7.4.电极内液组成(mM)：BaCl250,tetrathylammoniumchloride70,EGTA0.5,BayK86440.003,Hepes-CsOHbuffer10, pH7.4.

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌细胞的分离

大鼠心室肌细胞的分离：采用大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠110mg/Kg进行麻醉，置仰卧位固定，实行气管插管，末端接连小动物呼吸机，然后打开胸腔，使心脏和主动脉暴露于体外，再进行主动脉插管，最后将游离的心脏置于Langendorff装置进行主动脉逆行灌流.先用含钙台式液灌流约3min，再用无钙台式液灌流约6min，然后再用胶原酶消化40min左右，最后用KB液冲洗残酶约5min.整个灌流系统用恒温水浴保持在37℃，所有液体均用纯氧饱和后再进行试验.灌流完毕后，取下心脏，放入室温的KB液中机械分离细胞，得到单个细胞悬液.经105μm的钢丝膜过滤后，置于含有蛋白酶的KB液中37℃水浴均匀震荡4min.离心3次(1000r/min)去除残留酶，最后置于4℃的KB液静置1h后进行实验.

取细胞悬液滴加入到显微镜灌流浴槽中，待细胞沉底后用IO液进行灌流，采用膜片钳细胞贴附和膜内向外两种记录细胞膜L型钙通道的单通道电流，保持电位-70mV去极至0mV引出电流，波宽200ms，刺激频率0.5Hz，经由膜片钳放大器进行记录后，以3.3kHz的采集速度将数据输入计算机.用pClamp10.0软件记录数据并以pClamp分析软件进行分析.

2 结果

2.1 大鼠心室肌细胞的分离

经上述方法分离后，得到存活的单个心室肌细胞达40%～50%；高倍镜下可见，存活细胞形态良好，呈杆状或柱状，具有清晰的横纹肌.

图1 分离的大鼠心室肌细胞

图2 大鼠心室肌细胞钙电流单通道记录

图3 钙通道关闭时间分布普通直方图：τc=78.94ms

3 讨论

3.1 心肌细胞的分离是整个实验的重要基础，膜片钳实验要求细胞标本具有呼吸活性、耐钙、细胞膜完整、平滑、清洁度高的条件，以利于微电极与细胞膜进行高阻封接.心肌细胞分离有四个重要的因素，分别是手术的把握、灌流液的温度以及pH值、水质、胶原酶的用量及时间等.

3.2 钙通道普遍存在于机体的各种组织和细胞，其功能主要是调节细胞内钙离子浓度[8].细胞内的游离钙离子对组织和细胞的各种生理活动具有广泛地调控作用，是及其重要的第二信使.钙离子对细胞功能和生理反应的调节作用是通过钙信号系统来完成的，该系统几乎参与了肌肉收缩、神经递质释放、基因表达等所有的生理过程.

3.3 心肌细胞的单通道的研究工作，修正了早期对离子流闸门（激活与失活）活动的认识，证实了一些以往只能从理论上进行的推测.更为重要的是，在应用这种技术后，不断的发现了一些新的离子流和离子通道.

4 结论

4.1 采用Langendorff灌流，Worthington胶原酶法分离并得到了大鼠心室肌细胞,细胞存活形态良好.应用膜片钳制技术单通道模式记录并得到了大鼠心室肌细胞的钙电流.

4.2 本实验项目为基础实验研究，可作为Inside out等相关科研实验的前期工作.

4.3 心肌细胞钙离子电流的变化在心血管疾病的发生发展过程中起了重要作用，其重要性已经受到人们越来越多的重视，对钙通道的生理功能、特性及其作用药物的方面的研究也将在心血管系统疾病及其他系统疾病中发挥重要作用.

〔1〕HamillO,MartyA,NeherEetal.Improved patch-clamptechniquesforhigh-resolution currentrecordingfromcellsandcell-free membranepatches.PflugersArch,1981;391(1):85.

〔2〕WeidmannS.Themicroelectrodeandthe heart1950-1970.InKaoFF,KoizumK, VassaleM(eds).ResearchinPhysiology[M]. AuloCaggiPublisher,Bolognal.19713-25.

〔3〕NeherE,SakmannB.Singlechannelcurrents recordedfrommembraneofdenervatedfrog musclefibers.Nature,1976,260:799-802.

〔4〕赵卫红,吴宇澄,王笑云,等.耐钙心肌细胞的分离及其L型钙通道电流观察[J].南京医科大学学报:自然科学版,2003,23(1):21-23.

〔5〕ZhangJ.SongJ.WuDM．Analysisofemergentisolationmethodforcardiacmyoeytesin patchclampstudies[J].ChinJlntegrMedCardio一CerebrovDis，2008，6(10)1238-9.

〔6〕HintzKK,NorbyFI,DuanJH,eta1.Comparisonofcardiacexcitationcontractioncouplinginimlatedventricularmyocytesbetween ratandmouse.CompBioehemandPhysiol, 2002,133(1):191.

〔7〕ShangLJ,ZangYM,WangSW.Isolation ofcalcium-tolerantsinglemyocardialcellsand itselectrophysiologicalproperties[J].FourthMil MedUniv,2000,21(2):247-9.

〔8〕YangXiangjun,HuiJie,JiangTingbo,Song Jianping,LiuZhihua.Characteristicsofsingle Ca2+channelkineticsinfelinehypertrophied ventricularmyocytesandJIANGWenping. ChineseMedicalJournal2002;115(4):502-508.

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1673-260X（2013）06-0105-02