地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养优化的研究

朱天辉，李姝江，向潇潇，谯天敏

(四川农业大学林学院，四川 雅安 625014)

地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，是一种革兰氏阳性细菌［1］，在自然界分布非常广泛，是土壤和植物微生态优势种群［2］。它对多种植物病原菌有很强的抑制作用，如对镰刀菌、核盘菌、稻瘟病病菌和水稻纹枯病病菌等具有较强的抑菌活性，表现出很好的生防潜力［3～8］。在对番茄灰霉病的田间防效试验中，地衣芽孢杆菌与化学药剂腐霉利效果相当，可达60%以上［9］;并且还具有在番茄植株体表定殖竞争能力［10］和诱导植株产生系统抗性的能力［11］;可以产生多种抗生物质，其抗菌蛋白对苹果轮纹病菌、炭疽病菌的抑制作用使其对轮纹病具有防治作用［12］。

地衣芽孢杆菌YB15是从健康的撑×绿杂交竹上分离获得的一株对撑×绿杂交竹梢枯病病原菌(暗孢节菱孢菌)有很好的抑制作用的优势拮抗菌株。本试验旨在对地衣芽孢杆菌YB15 的发酵培养基及其培养条件进行优化，为撑×绿杂交竹梢枯病生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

拮抗菌:地衣芽孢杆菌YB15(Bacillus lincheniformis)

病原菌:暗孢节菱孢菌(Arthrinium phaeospermum)(森林保护实验室)

1.1.2 培养基

PDA 培养基:马铃薯200 g，葡萄糖15 g～20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml，0.1 MPa 灭菌30 min。

牛肉膏蛋白胨培养基(基础培养基):牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml，pH 值7.0，0.1 MPa 灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌与拮抗菌的处理

将实验室保存的暗孢节菱孢菌接种到新鲜的PDA 培养基上，25 ℃培养，直到病原菌长满，取出，用5 mm 直径打孔器打孔得菌饼，待用。

取培养48 h 的地衣芽孢杆菌YB15 斜面，用10 ml 无菌水将其洗下，作为发酵种子液，取其3 ml 接入100 ml 的牛肉膏蛋白胨基础培养基中，25 ℃，140 r·min－1旋转培养72 h，待用。

1.2.2 抑菌活性的测定

地衣芽孢杆菌YB15 发酵无菌滤液的制备:取25 ℃，140 r·min－1旋转培养72 h 后的发酵液，于4℃下6 000 rpm 离心10 min，取其上清液，过0.22 μl的细菌过滤器，得到无菌滤液。

抑菌活性测定采用孔洞法，将暗孢节菱孢菌饼接种到PDA 平板中央，在距菌饼1 cm 相互垂直的4个方向，用5 mm 打孔器打孔，其中3个孔中加入80 μl 地衣芽孢杆菌YB15 发酵无菌滤液，另外一个孔加入等量无菌水做对照，然后进行恒温培养，4 d 后测定抑菌圈直径。

1.2.3 发酵培养基组分的单因素试验

碳源:分别选择葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、糊精等，等量代替基础培养基中的碳源，25℃，140 r·min－1旋转培养48 h，测定不同碳源对地衣芽孢杆菌YB15 抑菌活性的影响。

氮源:分别以酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏+蛋白胨、酵母浸膏+蛋白胨、酵母浸膏+蛋白胨+氯化铵、酵母浸膏+蛋白胨+硫酸铵等，等量代替基础培养基中的氮源，25 ℃，140 r·min－1旋转培养48 h，测定不同氮源对地衣芽孢杆菌YB15 抑菌活性的影响。

无机盐:分别以磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、硝酸钾等，等量代替基础培养基中的氯化钠，25 ℃，140 r·min－1旋转培养48 h，测定不同无机盐对地衣芽孢杆菌YB15 抑菌活性的影响。

1.2.4 发酵培养基组分优化

结合单因素试验结果，设计正交试验进行培养基组分的优化，每种培养基3次重复，测定不同培养基组分配比对地衣芽孢杆菌YB15 抑菌活性的影响，正交试验因素编码表设计如下(见表1)。

表1 地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养基组分正交试验因素编码表

1.2.5 发酵培养基条件优化

结合发酵培养基组分正交试验的最优结果，设计正交试验进行培养基条件的优化，每种培养基3次重复，测定不同发酵条件对地衣芽孢杆菌YB15抑菌活性的影响，正交试验因素编码表设计如下(见表2)。

表2 地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养条件正交试验因素编码表

1.2.6 生长曲线的测定

以培养基优化后的最优方案处理以下各培养基，将4 ml 发酵种子液转入100 ml 最优培养基中(共21 瓶)于25 ℃，140 r·min－1摇床培养。每6 h取出一瓶，以分光光度法在波长650 nm 处测出各发酵液OD 值，以培养0 h 的发酵液OD 值为对照，测定时间为0～102 h。最后以发酵时间(h)为横轴，以各无菌发酵液的OD 值为纵轴绘出生长曲线。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基组分的单因素试验

从图1可以看出，当使用麦芽糖和葡萄糖作为碳源，等量代替基础培养基中的碳源进行培养时，地衣芽孢杆菌YB15 的抑菌圈直径都较大，抑菌活性都较强，但效果相差不大，而葡萄糖则更加经济易得。所以，地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养基的最适碳源是葡萄糖。

从图2可以看出，当使用酵母浸膏+蛋白胨+硫酸铵等作为氮源，等量代替基础培养基中的氮源进行培养时，地衣芽孢杆菌YB15 的抑菌圈直径最大，抑菌活性最强。所以，地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养基的最适氮源是酵母浸膏+蛋白胨+硫酸铵。

图1 不同碳源对地衣芽孢杆菌YB15 抑菌活性的影响

图2 不同氮源对地衣芽孢杆菌YB15 抑菌活性的影响

从图3可以看出，当使用原基础培养基中的无机盐进行培养时，地衣芽孢杆菌YB15 的抑菌圈直径最大，抑菌活性最强。所以，地衣芽孢杆菌YB15发酵培养基的最适无机盐仍为氯化钠。

图3 不同无机盐对地衣芽孢杆菌YB15 抑菌活性的影响

2.2 发酵培养基组分优化

正交试验培养基组分优化的方差分析显示(见表3)，以上各不同处理导致地衣芽孢杆菌YB15 的抑菌圈直径差异极显著。SSR 法对各处理进行多重比较，结果表明(见表4)，9种不同处理中以3 号处理的抑菌圈直径最大，且显著大于其他处理，因此发酵培养基的最适配比为葡萄糖5.0 g，酵母浸膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，硫酸铵5.0 g。

表3 地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养基组分正交试验方差分析

表4 地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养基组分多重比较

2.3 发酵培养基条件优化

正交试验的发酵培养条件优化方差分析(表5)表明，以上各不同发酵条件导致地衣芽孢杆菌YB15的抑菌圈直径差异极显著。

各发酵条件因素进行单因素方差分析结果(表6)显示，不同温度导致的地衣芽孢杆菌YB15 抑菌圈直径差异极显著，而不同pH、瓶装量和接种量之间差异不显著。

表5 地衣芽孢杆菌YB15 发酵培养基条件正交试验方差分析

表6 发酵条件单因素方差分析

SSR 法对温度各不同处理进行多重比较(见表7)，显示2 号处理的抑菌圈直径最大，因此地衣芽孢杆菌YB15 的发酵培养的最适条件为2 号处理，即25 ℃，pH 值为6.5，瓶装量为100 ml，接种量为4 ml。

表7 不同温度处理的多重比较

2.4 生长曲线的测定

由图4可知，在以上实验得出的发酵培养基最适组分和培养最适条件下，发酵种子液接入最优培养基0～6 h 为菌体生长延迟期，镜检可见菌体小、数量极少;从6 h 以后进入对数生长期，镜检结果菌体数量急剧增多，菌体形态增大增长，并开始形成芽孢;在18 h 以后，地衣芽孢杆菌处于生长的稳定期，菌体生长缓慢，镜检可知菌体全部形成芽孢，孢囊略为膨大。地衣芽孢杆菌YB15 的发酵周期为18 h～20 h。所以应在12 h～18 h 时收集菌体，因为这时地衣芽孢杆菌YB15 处于对数生长末期，此时收集菌体既可保持较高的细胞活性，又可得到尽可能多的细胞数。

图4 地衣芽孢杆菌YB15 生长曲线

3 结论与讨论

本试验采用单因素实验法确定了地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)YB15 发酵培养基的碳源、氮源、无机盐的最适组分，并通过正交试验得出发酵培养基组分的最适配比为葡萄糖5.0 g，酵母浸膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，硫酸铵5.0 g。另外，最适培养条件为25 ℃，pH 值为6.5，瓶装量为100 ml，接种量为4 ml。在此优化条件下，地衣芽孢杆菌YB15 的生长对数期为6 h～18 h，收集菌体的最佳时间为12 h～18 h。发酵周期为18 h～20 h，与丰贵鹏和杨丽云［13］的实验结果，发酵周期为22 h～24 h 相比，缩短了4 h，比经验周期缩短了14 h;与刘莹等［14］的实验结果中从21 h 开始进入衰亡期相比，大大延长了地衣芽孢杆菌的稳定期;谷春涛［15］研究发现地衣芽孢杆菌TS－01 的最适生长温度为40 ℃，且微量MnSO4可促进其产孢量的增减。众多关于地衣芽孢杆菌发酵条件研究结果有所差异，可能是由于不同生理小种的特性不同，或者是环境条件各异，具体原因有待进一步的探讨。

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