黑孢块菌、夏块菌菌根苗培育及菌根检测技术研究

林 强，冉晓潇，赵 军，刘应雄，柳成益，韩 灯

(1.四川林业科学研究院，四川 成都 610081;2.攀枝花市林业局，四川 攀枝花;617000，3.攀枝花市农林科学院，四川 攀枝花 617065;4.北川县林业局，四川 北川 622750;5.松潘县林业局，四川 松潘县 623302)

块菌(Truffle)，属子囊菌亚门(Ascomycotina)，块菌目(Tuberales)，块菌科(Tuberaceae)，块菌属(Tuber Micheli :F.H.Wigg.)。欧洲常见的块菌种类60余种，商业块菌的种类，主要是黑孢块菌，夏块菌和意大利白块菌。商业的块菌素有“黑钻石”之称，是食用菌中最珍稀的种类，鲜块菌价格在欧洲市场500 欧元·kg－1～1 500欧元·kg－1。

1 材料和方法

本研究供试材料黑孢块菌(Tuber melanosporum)，夏块菌(Tuber aestivum)由意大利皮埃蒙特大区IPLA 林业环境研究所提供。

1.1 种质资源和生态学属性

黑孢块菌(Tuber melanosporum)分布在法国、意大利、西班牙等欧洲国家，目前引种到加拿大、美国、澳大利亚、新西兰等国家已经获得栽培成功。直径5 cm～15 cm 不等，重量从数十克到1 kg。与中国的印度块菌形态特征和遗传特征都十分相似。宿主植物有:欧洲栎、欧洲榛子、雪松、榆树、山毛榉等多种植物。我们同样也在云南松、滇榛、板栗上成功接种了黑孢块菌。生长土壤要求含钙质较高，pH 值7.5～8.5 范围，冬季平均温度1℃～8℃，夏季平均温度17.5℃～22.5℃，年平均降雨量600 mm～1 500 mm 出产季节，从头年10月到次年3月。

夏块菌(Tuber aestivum)分布在法国、意大利、西班牙等欧洲国家，我国攀西地区会东县也发现有夏块菌分布。目前引种到澳大利亚、新西兰等栽培获得成功。直径2 cm～10 cm，重量可以达到几十克到几百克。在晚夏和早秋成熟，生长温度与黑孢块菌类似，土壤pH 值6.5～8.5。分布接近土表。宿主植物主要有:欧洲榛子、欧洲栎。我们也在云南松、滇榛、板栗上接种获得成功(参见图1)。

图1 欧洲黑孢块菌(左)及夏块菌(右)

1.2 宿主植物云南松无菌苗培育

收集优质的云南松母树园种子用水选法去除空壳种子，用0.1%的高锰酸钾液浸泡处理30 min，用自来水冲洗去表面残留的高锰酸钾溶液，然后再用清水浸泡1 d～2 d，在这期间换一次清水。将表面灭菌处理后的云南松种子播人混合基质的培育箱中，培养基质为蛭石与珍珠岩的混合物，其体积比为蛭石∶珍珠岩∶泥炭土为1∶1∶1，在121℃～126℃的高压灭菌器下灭菌2.5 h～3 h 放置一周后使用。播种后，用清水将基质浇透后放置于室内催芽，待80%以上的种子发芽后再移入炼苗室内进行无菌苗培育，需注意的是温度要保持在10℃～30℃之间，基质的湿度保持在50%～70%。云南松无菌苗培育3月以上，根部开始木质化后即可进行接种。

1.3 宿主植物接种方法

1.3.1 菌剂的配制方法

将供试的和黑孢块菌及夏块菌分别在碾钵内磨成粉状，粉状菌种按1∶1的比例和细沙混合即为接种的菌剂，菌剂要随用随配，用不完的需要在冰箱2℃～5℃环境冷藏保存。

1.3.2 接种

将培育好的云南松无菌苗浸泡在自来水里至根部基质松解，在适宜的容器内装入上述培灭菌基质，至2/3 深度，然后用小勺舀一勺约3 g 上述菌剂，在容器基质表面，将云南松无菌苗栽入，使根部与菌剂接触，然后覆盖基质压紧，用水浇透，将接种苗放置在炼苗室培育半月，期间适当浇水，然后移到温室大棚育苗架上培养6个月。

1.4 检测方法

采用OLYMPUS SZ61Q 体式显微镜筛选感染须根，BX41 显微镜观测微观特征。囊状体即晶状附属物，鞘状细胞。

随机选择培育6个月龄云南松接种苗，在玻璃钵内浸泡1 h，用自来水冲洗干净，注意勿伤根部。检测:在解破镜下，先观测接种植物根部，通常感染发生在须根上，确认有感染征兆，再用镊子捏取或用解剖刀切取，感染部位。将切取材料在载玻片上放下，滴一滴清水，盖上盖玻片，挤压盖玻片，然后在显微镜下检测。

2 结果与分析

感染的典型的宏观特征，棒状的须根，二叉分枝，或则珊瑚状分枝;显微特征，随不同的块菌会不一样，一些在菌根表面的翘呈不规则的网格例如夏块菌，一些呈马赛克似的拼图，初期在菌根的表面还会出现囊状体－长长的丝状不分割的有点类似菌丝的附属物，菌根颜色初期为浅肉色，老时变黑，通常具有明显的苍白色的顶部，所有这些是检测的客观的标准(参见图2)。

图2 感染夏块菌菌根的宏观特征二叉、珊瑚状分枝及囊状体

用OLYMPUS BX41 光学显微镜检测。经检测可清晰的看到菌根表面的囊状体。囊状体着生在菌根表面，且不分支，较坚硬，囊状体基部细胞较大。菌丝是从根系表皮细胞间隙向皮层伸展，并在皮层细胞之间交织成网状。菌根表面未发现菌索和菌核。菌根横切面上能观察到哈蒂氏网(Hartig net)结构，野外菌根可清晰看到菌丝在营养根表繁殖，层层交织形成的菌套呈暗褐色或黑色，而根组织细胞清晰可见，呈浅褐色或褐色，块菌菌根具有囊状体及独特的菌套结构，这是块菌属菌根的显著特征。未形成菌根的营养根横切片，可见小而排列紧密的表皮细胞，其颜色与其它细胞无区别，均呈浅褐色或褐色。与苗圃中的菌根苗菌根观察效果有差别的是，菌根周围有杂菌侵染的情况，菌套颜色要深得多，与天然林中块菌接种后形态类似(参见图3，图4 和图5)。

图3 夏块菌感染苗须根表面特征

3 结论和讨论

云南松无菌苗的培育要严格遵从无菌操作技术，否则会造成严重的污染。采用孢子粉菌剂接种宿主植物，感染率极高，通常接种后半年可以观测到感染结果，这个是欧洲常规的块菌接种方法。

图4 黑孢块菌菌根形态

图5 黑孢块菌鞘状细胞

块菌菌根宏观上无论夏块菌还是黑孢块菌区别不大，甚至和大多数的其它菌根真菌很类似。但是微观特征有着明显的区别。第一块菌菌根感染初期，有不分割的丝状的囊状体细胞，第二夏块菌的鞘状细胞是不规则的网格状，而黑孢块菌则是不规则的多角形，有点类似马赛克花纹与印度块菌的花纹极为相似。

菌根微观显微特征是鉴别不同种块菌菌根的关键特征，形态学的特征检测，是欧洲最常用的菌根检测技术，进一步还可以采用DNA 指纹图谱技术鉴定感染的菌根块菌种类，特别是区分印度块菌和黑孢块菌需要分子生物学的分析手段。